Eine Mikrotiterplattenmethode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration eines Antibiotikums

Zusammenfassung

Quelle: Ketelboeter, L. M., et al. Methoden zur Hemmung der bakteriellen Pyomelaninproduktion und zur Bestimmung der entsprechenden Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress. J. Vis. Exp. (2015).

Dieses Video zeigt eine auf Mikrotiterplatten basierende Methode zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) von Testantibiotika gegen Bakterien. Nach Zugabe einer Suspension des bakteriellen Erregers Pseudomonas aeruginosa zu einer Mikrotiterplatte, die serielle Verdünnungen eines Testantibiotikums und eines Inhibitors der Produktion von Pyomelanin durch die Bakterien enthält, wird die optische Dichte der Vertiefungen gemessen, um die minimale Hemmkonzentration des Antibiotikums zu berechnen, und der Einfluss des Pyomelanin-Produktionshemmers auf die Antibiotikaempfindlichkeit der Bakterien.

Protokoll

>1. Assay für die minimale inhibitorische Konzentration (MIC) von Antibiotika in 96-Well-Platten

1. Über Nacht werden Kulturen der zu testenden Stämme in LB (Luria-Bertani) mit und ohne NTBC (2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandione) eingerichtet.
   Anmerkung: Dieses Protokoll wird mit dem repräsentativen Pegel von 300 μM NTBC beschrieben.
   1. 300 μM NTBC auf 2 ml LB zugeben. 2 ml LB ein äquivalentes Volumen Vehikel (Dimethylsulfoxid, DMSO) zugeben, um die Bedingung ohne NTBC
   zu erhalten.
   2. Beimpfen Sie die Röhrchen mit sterilen Zahnstochern mit einer isolierten Bakterienkolonie. Für jeden Stamm gibt es eine Kultur mit NTBC und eine Kultur ohne NTBC. Über Nacht bei 37 °C mit Belüftung mit einem Gewebekulturrotator in einem Luftinkubator inkubieren.
2. Stellen Sie am nächsten Tag LB + NTBC und LB + DMSO Master-Lösungen für die Einrichtung des MIC-Assays her. NTBC wird in einer Konzentration von 600 μM zugegeben, da dieses bei Zugabe des Inokulums um das Zweifache verdünnt wird, was eine Endkonzentration von 300 μM ergibt.
   1. Um ein Antibiotikum auf einen Stamm zu testen, fügen Sie 600 μM NTBC zu 2 ml LB hinzu und mischen Sie, um die NTBC-Masterlösung herzustellen. Fügen Sie 2 ml LB ein äquivalentes Fahrzeugvolumen (DMSO) hinzu und mischen Sie, um die Masterlösung ohne NTBC herzustellen. Verwenden Sie diese Lösungen zur Herstellung von Antibiotika-Stammlösungen sowie zum Einrichten der Verdünnungsreihe in 96-Well-Platten.
      Anmerkung: Die Formulierungen der Masterlösung liefern zusätzliche Lösungen, um Pipettierfehler zu berücksichtigen. Die Master-Lösungen können je nach Anzahl der getesteten Antibiotika und Stämme je nach Bedarf nach oben oder unten skaliert werden.
3. Bereiten Sie die Antibiotikalösungen in den Masterlösungen LB + NTBC oder LB + DMSO vor.
   Anmerkung: Die Antibiotikakonzentration in diesen Lösungen sollte doppelt so hoch sein wie die gewünschte Endkonzentration. Es sollte genügend Lösung hergestellt werden, um 100 μl in vier Vertiefungen in einer 96-Well-Platte zu überführen.
   1. Herstellen Sie Gentamicin +/- NTBC-Stammlösung mit 64 μg/ml. Um diese Lösung herzustellen, fügen Sie 0,288 μl Gentamicin (100 mg/ml) zu 450 μl LB + NTBC oder LB + DMSO Masterlösung hinzu.
      HINWEIS: Die maximale Konzentration von Gentamicin für Pseudomonas aeruginosa PAO1 beträgt 32 μg/ml.
   2. Stellen Sie die Kanamycin +/- NTBC-Stammlösung bei 256 μg/ml her. Um diese Lösung herzustellen, fügen Sie 3,84 μl Kanamycin-Stamm (30 mg/ml) zu 450 μl LB + NTBC oder LB + DMSO-Masterlösungen hinzu.
      Anmerkung: Die maximale Konzentration von Kanamycin für P. aeruginosa PAO1 beträgt 128 μg/ml.
   3. Tobramycin +/- NTBC-Stammlösung mit 8 μg/ml herstellen. Um diese Lösung herzustellen, fügen Sie 0,36 μl Tobramycin-Stamm (10 mg/ml) zu 450 μl LB + NTBC oder LB + DMSO-Masterlösungen hinzu.
      Anmerkung: Für P. aeruginosa PAO1 beträgt die maximale Konzentration von Tobramycin 4 μg/ml.
      Anmerkung: Die Antibiotika und Konzentrationen können für die zu testenden Bakterien angepasst werden.
4. Geben Sie 100 μl jeder 2x Antibiotikalösung in vier Vertiefungen in einer 96-Well-Platte. Platzieren Sie diese Lösungen in Reihe A. Zum Beispiel sollte Gentamicin in A1 bis A4 platziert werden, Kanamycin sollte in A5 bis A8 und Tobramycin in A9 bis A12 platziert werden. Abbildung 1A zeigt ein Diagramm eines 96-Well-Plattenaufbaus.
   Anmerkung: Es können mehrere Antibiotika in einer Platte getestet werden, aber es sollte nur ein Stamm pro Platte getestet werden, um das Potenzial einer Kreuzkontamination durch andere Stämme auszuschließen.
5. Geben Sie 50 μl der Masterlösung LB + NTBC oder LB + DMSO in die Reihen B bis H der 96-Well-Platte. Stellen Sie sicher, dass eine Platte LB + NTBC und eine Platte LB + DMSO ist. Siehe Abbildung 1A.
   1. Verwenden Sie LB + NTBC für die Antibiotika in LB + NTBC. Verwenden Sie LB + DMSO für die Antibiotika in LB + DMSO.
6. Mit einer Mikropipette werden die Antibiotika in zweifacher Reihe verdünnt, indem 50 μl der Lösung von Reihe A nach Reihe B übertragen werden. Mischen Sie die Lösung, wechseln Sie die Pipettenspitzen und übertragen Sie 50 μl der Lösung von Reihe B nach Reihe C. Wiederholen Sie den Vorgang für die verbleibenden Reihen. Nach dem Verdünnen von Reihe G werden 50 μl der Lösung aus dieser Reihe entnommen und verworfen. Verwenden Sie Reihe H als antibiotische Kontrolle gegen das Bakterienwachstum. Siehe Abbildung 1B.
   HINWEIS: Jede Vertiefung in den Reihen A bis G enthält nun 50 μl Antibiotikum in LB + NTBC oder LB + DMSO in der 2-fachen gewünschten Endkonzentration. Zeile H enthält LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika.
7. Messen Sie den OD₆₀₀ der Übernachtkulturen. Waschen Sie alle Kulturen, bevor Sie OD_{600-Messungen} vornehmen, um das in den Medien vorhandene Pyomelanin zu eliminieren.
   1. Waschen Sie die Kulturen, indem Sie 1 ml Kultur in einer Mikrozentrifuge bei 16.000 x g für 2 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml LB.
8. Verdünnen Sie die Übernachtkulturen auf 2,75 x 10⁵ KBE/ml in LB.
   Anmerkung: Nehmen wir an, dass eine OD_600-Einheit das Äquivalent von 1x10⁹ KBE/ml für P. aeruginosa ist. Die Umwandlung von OD in KBE/ml kann bei anderen Bakterien unterschiedlich sein.
9. 50 μl der verdünnten Bakterienkultur in die entsprechende Vertiefung geben.
   Anmerkung: Kulturen, die in NTBC gezüchtet wurden, sollten den Vertiefungen hinzugefügt werden, die NTBC enthalten, und Kulturen, die in DMSO gezüchtet wurden, sollten den Vertiefungen hinzugefügt werden, die DMSO enthalten. Siehe Abbildung 1B.
   1. Geben Sie Bakterien für jeden Stamm und jede Antibiotikakonzentration in drei Vertiefungen. Geben Sie 50 μl LB in die vierte Vertiefung, um die bakterielle Kontamination zu kontrollieren. Siehe Abbildung 1B.
   2. Verwenden Sie eine Mehrkanal-Mikropipette, um die Wells zu impfen. Stellen Sie sicher, dass sich die Pipettenspitzen in der Nähe des Bodens der Vertiefungen befinden, wenn Sie Inokulum hinzufügen, um eine Kontamination benachbarter Vertiefungen zu verhindern.
      Anmerkung: Durch das Hinzufügen von Bakterienkulturen zu den Vertiefungen werden die Antibiotika- und NTBC-Konzentrationen um das Doppelte verdünnt.
10. Die 96-Well-Platten mit Parafilm abdecken und ca. 24 Stunden bei 37 °C inkubieren. 96-Well-Platten statisch in einem Luftinkubator inkubieren.
11. Untersuchen Sie die Platten auf Bakterienwachstum in den Vertiefungen. Die MIC ist die niedrigste Konzentration von Antibiotika, bei der bei allen drei Replikaten jedes Stammes kein Bakterienwachstum zu beobachten ist.
    1. Untersuchen Sie die Platte visuell auf Wachstum oder lesen Sie sie mit einem Plattenlesegerät ab, das auf OD₆₀₀ eingestellt ist.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung des Antibiotika-MHK-Assays auf einer 96-Well-Platte. (A) 100 μl 2x Antibiotika der höchsten Ausgangskonzentration befinden sich in Reihe A. Die Reihen B bis H sind mit 50 μl entweder LB + NTBC oder LB + DMSO ohne Antibiotika gefüllt. (B) In den Reihen A bis G werden zweifache serielle Verdünnungen durchgeführt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2-[2-Nitro-4-(trifluormethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexandion (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Auch Nitisinon genannt. Löslich in DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 216763-100ML	30 Gew.-% in H2O. Stabilisiert.
gentamicin	Goldene Biografie	G-400-100	Löslich in H2O. Filter sterilisieren.
Kanamycin	Fisher Scientific	Nr. BP906-5	Löslich in H2O. Filter sterilisieren.
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Löslich in H2O. Filter sterilisieren.