>1. Herstellung von dünnen zweischichtigen Polyacrylamid (PA) Hydrogelen auf Multi-Well-Platten
- Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogel
Anmerkung: Siehe Abbildung 1.
- Bereiten Sie wässrige Lösungen her, die 3 - 10 % 40 % Stammacrylamidlösung (siehe Materialtabelle) und 0,06 - 0,6 % 2 % Bis-Acrylamid-Stammlösung (siehe Materialtabelle) enthalten, um Hydrogele mit einer einstellbaren Steifigkeit von 0,6 kPa bis 70 kPa herzustellen. Siehe Tabelle 1.
- Für 0,6 kPa Hydrogele mischen Sie 3 % Acrylamid mit 0,045 % Bis-Acrylamid. Für 3 kPa Hydrogele mischen Sie 5 % Acrylamid mit 0,074 % Bis-Acrylamid. Für 10 kPa Hydrogele mischen Sie 10 % Acrylamid mit 0,075 % Bis-Acrylamid. Für 20 kPa Hydrogele mischen Sie 8 % Acrylamid mit 0,195 % Bis-Acrylamid. Für 70 kPa Hydrogele mischen Sie 10 % Acrylamid mit 0,45 % Bis-Acrylamid.
HINWEIS: Weitere Details zum Erreichen der gewünschten PA-Hydrogel-Steifigkeit finden Sie an anderer Stelle.
- Bereiten Sie zwei wässrige Lösungen für jede gewünschte Hydrogelsteifigkeit vor. Lösung 1 ist so vorzubereiten, dass sie perlenfrei ist, und Lösung 2 sollte fluoreszierende Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,03 % und 0,1 μm enthalten (siehe Materialtabelle).
- Die Lösungen 1 und 2 werden 15 min lang durch Vakuum entgast, um den Sauerstoff zu eliminieren, von dem bekannt ist, dass er die Polymerisation der Lösungen hemmt.
- Geben Sie 0,6 % der 10 g/ml-Stamm-APS-Lösung und 0,43 % Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu Lösung 1, um eine Polymerisationsinitiierung zu ermöglichen. Handeln Sie schnell.
- Geben Sie 3,6 μl Lösung 1 in die Mitte jeder Vertiefung der 24-Well-Schale.
- Decken Sie die Vertiefungen sofort mit 12 mm unbehandelten runden Deckgläsern ab und lassen Sie Lösung 1 20 Minuten einwirken, damit sie vollständig polymerisiert.
- Klopfen Sie mit einer Spritzennadel vorsichtig auf eine Oberfläche, um an der Spitze einen kleinen Haken zu erzeugen, der das Entfernen der Deckgläser erleichtert. Heben Sie die Deckgläser mit der Spritzennadel an.
- Fügen Sie 0,6 % der 10 g/ml-Stamm-APS-Lösung und 0,43 % TEMED zu Lösung 2 hinzu. 2,4 μl der Mischung auf die erste Schicht in jeder Vertiefung der 24-Well-Schale geben.
- Decken Sie Lösung 2 mit kreisförmigen 12-mm-Glasdeckgläsern ab und drücken Sie sie mit einer Pinzette vorsichtig nach unten, um sicherzustellen, dass die Dicke der zweiten Schicht minimal ist. Lösung 2 20 min polymerisieren lassen.
- Geben Sie 500 μl 50 mM HEPES pH 7,5 in jede der Vertiefungen und entfernen Sie dann die Glasdeckgläser mit der Spritze, der Nadel und der Pinzette.
- Sterilisation, Kollagenbeschichtung und Äquilibrierung von Polyacrylamid-Hydrogelen
- Belichten Sie die Hydrogele 1 h lang in der Gewebekulturhaube mit UV-Strahlung, um die Sterilisation zu ermöglichen.
- Bereiten Sie ein Gemisch aus 0,5 % Gew./Volumen-Sulfosuccinimidyl-6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoat (Sulfo-SANPAH, siehe Materialtabelle) in 1 % DMSO und 50 mM HEPES pH = 7,5 vor.
- Geben Sie 200 μl dieser Lösung auf die Oberseite der Hydrogele. Setzen Sie sie 10 Minuten lang UV (302 nm) aus, um sie zu aktivieren.
- Waschen Sie die Hydrogele zweimal mit 1 mL 50 mM HEPES pH = 7,5. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass überschüssiger Vernetzer entfernt wird.
- Überziehen Sie die Hydrogele mit 200 μl 0,25 mg/ml Rattenschwanz-Kollagen I (siehe Materialtabelle) in 50 mM HEPES. Inkubieren Sie die Hydrogele mit der Kollagenlösung darüber über Nacht bei Raumtemperatur.
Anmerkung: Um Austrocknung/Verdunstung zu verhindern, stellen Sie die Multi-Well-Platten in ein sekundäres Containment und fügen Sie in Wasser getränkte Laborreinigungstücher in den inneren Rand des Containments ein.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop mit einem 40-fachen Objektiv, um die Dicke der Hydrogele zu messen. Lokalisieren Sie dazu die z-Positionen der unteren (dort, wo sich die Glasoberfläche befindet) und der oberen Ebene des Hydrogels (wo die Intensität der fluoreszierenden Kügelchen am höchsten ist). Subtrahieren Sie dann die Z-Positionen, um die Höhe zu bestimmen.
Anmerkung: Wir verwendeten ein inverses Epifluoreszenzmikroskop und ein 40-faches Objektiv mit numerischer Apertur 0,65, um die Dicke der Hydrogele zu messen. An dieser Stelle können auch Rasterkraftmikroskopie-Messungen (AFM) durchgeführt werden, um die genaue Steifigkeit der Hydrogele zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
- Bevor Sie die interessierenden Zellen auf die Hydrogele säen, geben Sie 1 ml Medium auf die Hydrogele und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min bis 1 h, um die Äquilibrierung sicherzustellen.
Anmerkung: Wir haben MCDB-131 Full Media hinzugefügt, da dies das Medium ist, in dem die Modell-Wirtszellen (HMEC-1) kultiviert wurden (siehe Schritt 2.1 für Details).
>2. Humane mikrovaskuläre Endothelzellkultur und Seeding auf Hydrogelen
- Kultur von HMEC-1-Zellen (humane, mikrovaskuläre Endothelzellen) in MCDB-131-Vollmedien, die MCDB-131-Medien enthalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 1 μg/ml Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle).
- Teilen Sie die konfluenten Kulturen alle 3 - 4 Tage 1:6 auf und bewahren Sie die Zellen bis zur Passage 40 auf.
- Einen Tag vor dem Experiment lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin/EDTA von ihrem Kulturgefäß. Waschen Sie zuerst die Zellen und ihr Kulturgefäß 1x mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann die entsprechende Menge von 0,25 % Trypsin/EDTA hinzu (2 mL pro 100-mm-Schale oder 75-cm-Kolben, 1 mL pro 60-mm-Schale oder 25-cm-Kolben), inkubieren Sie den Kolben bei 37 °C für 5 - 10 Minuten, um die Ablösung der Zellen von ihrem Substrat zu ermöglichen.
- Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie das gewünschte Volumen des MCDB-131-Vollmediums hinzufügen, pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellklumpen aufzubrechen, und geben Sie die Lösung dann in ein konisches Zentrifugenröhrchen.
- Schwenken Sie die Zelllösung vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, und nehmen Sie dann 20 μl der Lösung heraus und füllen Sie sehr vorsichtig die beiden Kammern unter dem Deckglas eines Glashämozytometers aus.
- Die Lösung der in dem konischen Zentrifugenröhrchen enthaltenen Zellen wird durch Zentrifugieren für 10 min bei 500 x g granuliert.
- Während der 10-minütigen Wartezeit zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie ein Mikroskop, fokussieren Sie mit einem 10-fachen Objektiv auf die Gitterlinien des Hämozytometers und verwenden Sie dann einen Handzählzähler, um die Anzahl der Zellen in einem Quadrat von 1 mm x 1 mm zu zählen.
- Bewegen Sie das Hämozytometer auf ein weiteres 1 mm x 1 mm Quadrat, zählen Sie die Zellen dort und wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal. Berechnen Sie den Durchschnitt der vier Messungen und multiplizieren Sie dann den Durchschnitt mit 104. Der Endwert ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen/ml in der Zellsuspension, die zentrifugiert wird.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem konischen Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass das Küvettenpellet nicht zerbrochen wird. Resuspendieren Sie die Zellen im MCDB-131-Vollmedium in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen/ml.
- Aussäen Sie die Zellen in Suspension auf den Hydrogelen, indem Sie zuerst das Medium entfernen, mit dem die Hydrogele inkubiert wurden, und dann 1 ml Zellsuspension auf jedes Hydrogel geben.
>3. Infektion menschlicher mikrovaskulärer Endothelzellen mit L. monocytogenes
- Drei Tage vor der Infektion ist der zu verwendende Lm-Stamm aus einem Glycerinstamm (gelagert bei -80 °C) auf eine BHI-Agarplatte zu streichen, die gegebenenfalls 7,5 μg/ml Chloramphenicol und 200 μg/ml Streptomycin enthält.
Anmerkung: Bei dem auszustreifenden Stamm kann es sich um einen Wildtyp oder eine Mutante handeln, die konstitutiv Fluoreszenz exprimiert (für die Immunfärbung JAT1045 verwendet wurde) oder Fluoreszenz unter dem ActA-Promotor exprimiert (für die Durchflusszytometrie oder Traktionskraftmikroskopie wurden JAT983 oder JAT985 verwendet).
- Die Platten bei 37 °C inkubieren, bis sich diskrete Kolonien gebildet haben (1 - 2 Tage).
- Am Tag vor der Infektion züchten Sie den gewünschten Stamm über Nacht, indem Sie ihn bei 150 U/min bei 30 °C in BHI-Medien mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol (falls zutreffend) schütteln.
- Geben Sie 5 ml BHI-Medium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 7,5 μg/ml Chloramphenicol hinzu (falls zutreffend) und inokulieren Sie dann eine einzelne Kolonie von der Agarplatte mit einer sterilen 10-μl-Spitze.
- Am nächsten Tag, kurz vor der Infektion, messen Sie die optische Dichte der Bakterienlösung bei 600 nm (OD600), indem Sie die Probe 1:5 verdünnen; verwenden Sie eine Küvette, die nur BHI enthält, als Blindwert.
- Die Übernachtkultur wird auf einen OD600-Wert von 0,1 verdünnt und unter 2-stündigem Schütteln bei 30 °C in BHI-Medien mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol (falls zutreffend) inkubiert, damit die Bakterien das Wachstum in logarithmischer Phase erreichen können.
- Messen Sie den OD600 der Bakterienlösung, der voraussichtlich bei 0,2 - 0,3 liegt. Wenn der OD600 höher ist, verdünnen Sie ihn auf 0,2 - 0,3 mit BHI allein.
- Nehmen Sie 1 ml Bakterienlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie es 4 Minuten lang bei 2.000 x g durch Zentrifugation bei Raumtemperatur herunter. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml PBS in Gewebekulturqualität in der Gewebekulturhaube. Waschen Sie die Bakterien noch zweimal, indem Sie sie 4 Minuten lang bei 2.000 x g bei Raumtemperatur schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in 1 ml PBS.
- Bereiten Sie die Infektionsmischung vor, indem Sie 10 oder 50 μl der in PBS resuspendierten Bakterien mit 1 ml MCDB-131 Vollmedium mischen, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI; d.h. die Anzahl der Bakterien pro Wirtszelle) von etwa 50 Bakterien pro Wirtszelle oder 10 Bakterien pro Wirtszelle.
- Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platten und achten Sie darauf, die Hydrogele oder die Zellen nicht zu beschädigen. Waschen Sie die Zellen 1x mit 1 mL MCDB-131 Full Medium und geben Sie dann 1 mL der Bakterien in jede Vertiefung
.
- Decken Sie den Teller mit dem Deckel ab und wickeln Sie die Teller mit Polyethylenfolie ein, um ein Auslaufen zu vermeiden. Legen Sie die Platten in die Zentrifuge und drehen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 200 x g, um die Invasion zu synchronisieren. Schieben Sie die Platten in den Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie 30 min lang bei 37 °C.
- Waschen Sie die Proben 4x mit dem vollen Medium MCDB-131 und geben Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach weiteren 30 Minuten durch ein Medium, das mit 20 μg/ml Gentamicin ergänzt wurde.
>4. Durchflusszytometrie zur Quantifizierung der extrazellulären Matrixsteifigkeit abhängiger Anfälligkeit von Wirtszellen für Infektionen
- Wiegen Sie 5 mg Kollagenase und geben Sie es in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Fügen Sie 10 ml 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und mischen Sie sie gut.
- 8 h nach der Infektion, entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platte und waschen Sie die Vertiefungen 1x mit Gewebekultur PBS. Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und geben Sie 200 μl des Trypsin-EDTA/Kollagenase-Gemisches in jede Vertiefung. Legen Sie diesen für 10 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator, um eine vollständige Ablösung der Zellen zu ermöglichen.
- Verwenden Sie für jede Vertiefung eine frische Pipette und pipettieren Sie die Mischung 8x auf und ab. Seien Sie vorsichtig, um die Zellen nicht zu beschädigen. Geben Sie 200 μl volles Medium in jede Vertiefung, um das Trypsin zu neutralisieren.
- Übertragen Sie die 400-μl-Zelllösung jeder Vertiefung in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit einer 35-μm-Zellsiebkappe (siehe Materialtabelle).
- Analysieren Sie 10.000 - 20.000 Zellen pro Probe mittels Durchflusszytometrie. Führen Sie eine Datenerfassung durch Durchflusszytometrie durch und bestimmen Sie den Prozentsatz infizierter Zellen pro Vertiefung mit der entsprechenden kommerziell erhältlichen Software. Verwenden Sie die Streudiagramme "Vorwärtsstreuung versus Seite", um den Großteil der Verteilung der Zellzahlen zu begrenzen.
HINWEIS:: Dies stellt die Analyse einzelner Zellen sicher und beseitigt Ablagerungen oder Zelldubletten oder Drillinge.
- Messen Sie das Fluoreszenzsignal von nicht infizierten Kontrollzellen und begrenzen Sie die Population infizierter Zellen unter Ausschluss der Autofluoreszenz.
Tabelle 1. Zusammensetzung von Polyacrylamid (PA)-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit. In dieser Tabelle sind der prozentuale Anteil der 40%igen Acrylamidlösung und der prozentuale Anteil der 2%igen Bis-Acrylamid-Lösung zur Erreichung einer bestimmten Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) in verschiedenen Spalten angegeben.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Elastizitätsmodul (E, kPa) | Acrylamid % (ab 40% Lager) | Bisacrylamid % (ab 2% Lagerbestand) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
