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>1. Herstellung von dünnen zweischichtigen Polyacrylamid (PA) Hydrogelen auf Multi-Well-Platten
- Ammoniumpersulfat (APS) wird in destilliertem Reinstwasser gelöst, um eine Endkonzentration von 10 g/ml zu erreichen. Aliquotieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei 4 °C für den kurzfristigen Gebrauch (3 Wochen).
HINWEIS: Die obige Lösung kann vor der Herstellung des Hydrogels hergestellt werden.
- Glasaktivierung von 24-Well-Schalen
- 24-Well-Glasbodenplatten mit Wells mit 13 mm Durchmesser (siehe Materialtabelle) werden 1 h lang mit 500 μl 2 M Natriumhydroxid (NaOH) pro Well bei Raumtemperatur inkubiert.
- Spülen Sie die Vertiefungen 1x mit Reinstwasser und geben Sie dann 500 μl 2% (3-Aminopropyl) Triethoxysilan (siehe Materialtabelle) in 95% Ethanol für 5 min in jede Vertiefung
.
- Spülen Sie die Vertiefungen noch einmal 1x mit Wasser aus und geben Sie 500 μL 0,5% Glutaraldehyd für 30 min in jede Vertiefung. Spülen Sie die Vertiefungen 1x mit Wasser aus und trocknen Sie sie bei 60 °C bei abgenommenem Deckel.
- Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogel
HINWEIS: Siehe Abbildung 1.
- Bereiten Sie wässrige Lösungen her, die 3 - 10 % 40 % Stammacrylamidlösung (siehe Materialtabelle) und 0,06 - 0,6 % 2 % Bis-Acrylamid-Stammlösung (siehe Materialtabelle) enthalten, um Hydrogele mit einer einstellbaren Steifigkeit von 0,6 kPa bis 70 kPa herzustellen. Siehe Tabelle 1.
- Für 0,6 kPa Hydrogele mischen Sie 3 % Acrylamid mit 0,045 % Bis-Acrylamid. Für 3 kPa Hydrogele mischen Sie 5 % Acrylamid mit 0,074 % Bis-Acrylamid. Für 10 kPa Hydrogele mischen Sie 10 % Acrylamid mit 0,075 % Bis-Acrylamid. Für 20 kPa Hydrogele mischen Sie 8 % Acrylamid mit 0,195 % Bis-Acrylamid. Für 70 kPa Hydrogele mischen Sie 10 % Acrylamid mit 0,45 % Bis-Acrylamid.
HINWEIS: Weitere Details zum Erreichen der gewünschten PA-Hydrogel-Steifigkeit finden Sie an anderer Stelle.
- Bereiten Sie zwei wässrige Lösungen für jede gewünschte Hydrogelsteifigkeit vor. Lösung 1 ist so vorzubereiten, dass sie perlenfrei ist, und Lösung 2 sollte fluoreszierende Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 0,03 % und 0,1 μm enthalten (siehe Materialtabelle).
- Die Lösungen 1 und 2 werden 15 min lang durch Vakuum entgast, um den Sauerstoff zu eliminieren, von dem bekannt ist, dass er die Polymerisation der Lösungen hemmt.
- Geben Sie 0,6 % der 10 g/ml-Stamm-APS-Lösung und 0,43 % Tetramethylethylendiamin (TEMED) zu Lösung 1, um eine Polymerisationsinitiierung zu ermöglichen. Handeln Sie schnell.
- Geben Sie 3,6 μl Lösung 1 in die Mitte jeder Vertiefung der 24-Well-Schale (siehe Schritt 1.2 für die Zubereitung).
- Decken Sie die Vertiefungen sofort mit 12 mm unbehandelten runden Deckgläsern ab und lassen Sie Lösung 1 20 Minuten einwirken, damit sie vollständig polymerisiert.
- Klopfen Sie mit einer Spritzennadel vorsichtig auf eine Oberfläche, um an der Spitze einen kleinen Haken zu erzeugen, der das Entfernen der Deckgläser erleichtert. Heben Sie die Deckgläser mit der Spritzennadel an.
- Fügen Sie 0,6 % der 10 g/ml-Stamm-APS-Lösung und 0,43 % TEMED zu Lösung 2 hinzu. 2,4 μl der Mischung auf die erste Schicht in jeder Vertiefung der 24-Well-Schale geben.
- Decken Sie Lösung 2 mit kreisförmigen 12-mm-Glasdeckgläsern ab und drücken Sie sie mit einer Pinzette vorsichtig nach unten, um sicherzustellen, dass die Dicke der zweiten Schicht minimal ist. Lösung 2 20 min polymerisieren lassen.
- Geben Sie 500 μl 50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) pH 7,5 in jede der Vertiefungen und entfernen Sie dann die Glasdeckgläser mit der Spritze, der Nadel und der Pinzette.
- Sterilisation, Kollagenbeschichtung und Äquilibrierung von Polyacrylamid-Hydrogelen
- Belichten Sie die Hydrogele 1 h lang in der Gewebekulturhaube mit UV-Strahlung, um die Sterilisation zu ermöglichen.
- Eine Mischung aus 0,5 % Gew./Volumen-Sulfosuccinimidyl-6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoat (Sulfo-SANPAH, siehe Materialtabelle) in 1 % Dimethylsulfoxid (DMSO) und 50 mM HEPES pH = 7,5 herstellen.
- Geben Sie 200 μl dieser Lösung auf die Oberseite der Hydrogele. Setzen Sie sie 10 Minuten lang UV (302 nm) aus, um sie zu aktivieren.
- Waschen Sie die Hydrogele zweimal mit 1 mL 50 mM HEPES pH = 7,5. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf, um sicherzustellen, dass überschüssiger Vernetzer entfernt wird.
- Überziehen Sie die Hydrogele mit 200 μl 0,25 mg/ml Rattenschwanz-Kollagen I (siehe Materialtabelle) in 50 mM HEPES. Inkubieren Sie die Hydrogele mit der Kollagenlösung darüber über Nacht bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Um Austrocknung/Verdunstung zu verhindern, stellen Sie die Multi-Well-Platten in ein sekundäres Containment und geben Sie in Wasser getränkte Laborreinigungstücher in den inneren Rand des Containments.
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop mit einem 40-fachen Objektiv, um die Dicke der Hydrogele zu messen. Lokalisieren Sie dazu die z-Positionen der unteren (dort, wo sich die Glasoberfläche befindet) und der oberen Ebene des Hydrogels (wo die Intensität der fluoreszierenden Kügelchen am höchsten ist). Subtrahieren Sie dann die Z-Positionen, um die Höhe zu bestimmen.
HINWEIS: Wir haben ein inverses Epifluoreszenzmikroskop und ein 40-faches Objektiv mit numerischer Apertur 0,65 verwendet, um die Dicke der Hydrogele zu messen. An dieser Stelle können auch Messungen mit der Rasterkraftmikroskopie (AFM) durchgeführt werden, um die genaue Steifigkeit der Hydrogele zu bestätigen (siehe Abbildung 2).
- Bevor Sie die interessierenden Zellen auf die Hydrogele säen, geben Sie 1 ml Medium auf die Hydrogele und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 30 min bis 1 h, um die Äquilibrierung sicherzustellen.
HINWEIS: Wir haben MCDB-131 Full Media hinzugefügt, da dies das Medium ist, in dem die Modell-Wirtszellen (HMEC-1) kultiviert wurden (siehe Schritt 2.1 für Details).
>2. Humane mikrovaskuläre Endothelzellkultur und Seeding auf Hydrogelen
- Kultur von HMEC-1-Zellen (humane, mikrovaskuläre Endothelzellen) in MCDB-131-Vollmedien, die MCDB-131-Medien enthalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 1 μg/ml Hydrocortison und 2 mM L-Glutamin (siehe Materialtabelle).
- Teilen Sie die konfluenten Kulturen alle 3-4 Tage 1:6 auf und bewahren Sie die Zellen bis zur Passage 40 auf.
- Einen Tag vor dem Experiment lösen Sie die Zellen mit 0,25 % Trypsin/EDTA von ihrem Kulturgefäß. Waschen Sie zuerst die Zellen und ihr Kulturgefäß 1x mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und fügen Sie dann die entsprechende Menge von 0,25 % Trypsin/EDTA hinzu (2 mL pro 100-mm-Schale oder 75-cm-Kolben, 1 mL pro 60-mm-Schale oder 25-cm-Kolben), wobei Sie den Kolben 5 - 10 Minuten lang bei 37 °C inkubieren, um die Ablösung der Zellen von ihrem Substrat zu ermöglichen.
- Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie das gewünschte Volumen des MCDB-131-Vollmediums hinzufügen, pipettieren Sie vorsichtig, um die Zellklumpen aufzubrechen, und geben Sie die Lösung dann in ein konisches Zentrifugenröhrchen.
- Schwenken Sie die Zelllösung vorsichtig, um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig verteilt sind, und nehmen Sie dann 20 μl der Lösung heraus und füllen Sie sehr vorsichtig die beiden Kammern unter dem Deckglas eines Glashämozytometers aus.
- Die Lösung der in dem konischen Zentrifugenröhrchen enthaltenen Zellen wird durch Zentrifugieren für 10 min bei 500 x g granuliert.
- Während der 10-minütigen Wartezeit zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Verwenden Sie ein Mikroskop, fokussieren Sie mit einem 10-fachen Objektiv auf die Gitterlinien des Hämozytometers und verwenden Sie dann einen Handzählzähler, um die Anzahl der Zellen in einem Quadrat von 1 mm x 1 mm zu zählen.
- Bewegen Sie das Hämozytometer auf ein weiteres 1 mm x 1 mm Quadrat, zählen Sie die Zellen dort und wiederholen Sie den Vorgang noch zwei Mal. Berechnen Sie den Durchschnitt der vier Messungen und multiplizieren Sie dann den Durchschnitt mit 104. Der Endwert ist die Anzahl der lebensfähigen Zellen/ml in der Zellsuspension, die zentrifugiert wird.
- Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem konischen Zentrifugenröhrchen und stellen Sie sicher, dass das Küvettenpellet nicht zerbrochen wird. Resuspendieren Sie die Zellen im MCDB-131-Vollmedium in einer Konzentration von 4 x 105 Zellen/ml.
- Aussäen Sie die Zellen in Suspension auf den Hydrogelen, indem Sie zuerst das Medium entfernen, mit dem die Hydrogele inkubiert wurden, und dann 1 ml Zellsuspension auf jedes Hydrogel geben.
>3. Infektion menschlicher mikrovaskulärer Endothelzellen mit Listeria monocytogenes (Lm)
- Vorbereitung im Voraus
HINWEIS: Bereiten Sie die folgenden Lösungen im Voraus vor.
- Streptomycin-, Chloramphenicol- und Gentamicin-Aktien
- Bereiten Sie 50 mg/ml Streptomycin-Stammlösungen vor, indem Sie 0,5 g Streptomycinsulfat wiegen und vollständig in 10 ml Reinstwasser auflösen.
- Bereiten Sie 7,5 mg/ml Chloramphenicol-Stammlösungen vor, indem Sie 75 mg Chloramphenicol wiegen und vollständig in 10 ml 100%iges Ethanol auflösen.
- Bereiten Sie 20 mg/ml Gentamicin-Stammlösungen vor, indem Sie 0,2 g Gentamicinsulfat abwiegen und vollständig in 10 ml Reinstwasser auflösen.
- Sterilisieren Sie alle Stammlösungen mit einem 0,2-μm-Spritzenvorsatzfilter und lagern Sie sie bei -20 °C für den Langzeitgebrauch (1 - 2 Monate).
- Hirn-Herz-Infusionsmedien (BHI) und Agarplatten
- Stellen Sie zwei 1-Liter-Kolben auf und fügen Sie in jedem Kolben einen magnetischen Rührstab hinzu.
- Für das BHI-Medium geben Sie 37 g BHI-Pulver in einen Kolben und fügen Reinstwasser bis zu 1 l hinzu. Mischen Sie die Lösung kräftig, indem Sie den Kolben auf eine magnetische Rührplatte stellen, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
- Für die BHI-Agarplatten geben Sie 37 g BHI-Pulver und 15 g granuliertes Agar (siehe Materialtabelle) in den zweiten Kolben und fügen Reinstwasser bis zu 1 l hinzu. Mischen Sie die Lösung, indem Sie den Kolben auf eine magnetische Rührplatte stellen, bis sich das Pulver aufgelöst hat.
- Schrauben Sie die Deckel der Kolben nicht zu fest und autoklavieren Sie die Lösungen mit der Flüssigkeitseinstellung oder gemäß den Vorgaben des Autoklaven.
- Nehmen Sie die Lösung aus dem Autoklaven und kühlen Sie die Agar-BHI-Lösung auf 55 °C ab. Wenn das BHI-Medium im 1-L-Kolben steril gehalten wird, kann es bis zu einem Monat verwendet werden.
- Zur Herstellung der Bakterien-Agar-BHI-Platten geben Sie zunächst gegebenenfalls Antibiotika in den Kolben, der BHI und Agar enthält (abhängig von den zu züchtenden Bakterienstämmen). Stellen Sie den Kolben kurz auf eine magnetische Rührplatte, um ein schnelles Mischen zu ermöglichen.
HINWEIS: Die hier verwendeten Antibiotika sind spezifisch für die verwendeten Lm-Stämme, aber alle notwendigen Antibiotika können in BHI-Agarplatten verwendet werden. Wir fügten Streptomycin bis zu einer Konzentration von 200 μg/ml und Chloramphenicol bis zu einer Konzentration von 7,5 μg/ml hinzu, da 10403S Lm-Stämme resistent gegen Streptomycin sind. Diese Stämme wurden mit einem Plasmid konjugiert, das den offenen Leserahmen der Chloramphenicol-Acetyltransferase enthält, daher die Resistenz gegen Chloramphenicol.
- Gießen Sie die Mischung in 10 cm große Kulturplatten aus Polystyrolbakterien (ca. 20 ml pro Platte). Um Blasen zu entfernen, flammen Sie die Oberseite der Platten kurz ab. Teller über Nacht bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Am nächsten Tag die trockenen Platten verschließen und bei 4 °C lagern.
- Infektion humaner mikrovaskulärer Endothelzellen mit L. monocytogenes
- Drei Tage vor der Infektion ist der zu verwendende Lm-Stamm aus einem Glycerinstamm (gelagert bei -80 °C) auf eine BHI-Agarplatte zu streichen, die gegebenenfalls 7,5 μg/ml Chloramphenicol und 200 μg/ml Streptomycin enthält.
HINWEIS: Bei dem auszustreifenden Stamm kann es sich um einen Wildtyp oder eine Mutante handeln, die konstitutiv Fluoreszenz exprimiert (für die Immunfärbung JAT1045 verwendet wurde) oder Fluoreszenz unter dem ActA-Promotor exprimiert (für die Durchflusszytometrie oder Traktionskraftmikroskopie wurden JAT983 oder JAT985 verwendet).
- Die Platten bei 37 °C inkubieren, bis sich diskrete Kolonien gebildet haben (1 - 2 Tage).
- Am Tag vor der Infektion züchten Sie den gewünschten Stamm über Nacht, indem Sie ihn bei 150 U/min bei 30 °C in BHI-Medien mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol (falls zutreffend) schütteln.
- Geben Sie 5 ml BHI-Medium in ein konisches 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 7,5 μg/ml Chloramphenicol hinzu (falls zutreffend) und inokulieren Sie dann eine einzelne Kolonie von der Agarplatte mit einer sterilen 10-μl-Spitze.
- Am nächsten Tag, kurz vor der Infektion, messen Sie die optische Dichte der Bakterienlösung bei 600 nm (OD600), indem Sie die Probe 1:5 verdünnen; verwenden Sie eine Küvette, die nur BHI enthält, als Blindwert.
- Die Übernachtkultur wird auf einen OD600-Wert von 0,1 verdünnt und unter 2-stündigem Schütteln bei 30 °C in BHI-Medien mit 7,5 μg/ml Chloramphenicol (falls zutreffend) inkubiert, damit die Bakterien das Wachstum in logarithmischer Phase erreichen können.
- Messen Sie den OD600 der bakteriellen Lösung, der voraussichtlich bei etwa 0,2 bis 0,3 liegt. Wenn der OD600 höher ist, verdünnen Sie ihn auf 0,2 - 0,3 mit BHI allein.
- Nehmen Sie 1 ml Bakterienlösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie es 4 Minuten lang bei 2.000 x g durch Zentrifugation bei Raumtemperatur herunter. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Bakterienpellet in 1 ml PBS in Gewebekulturqualität in der Gewebekulturhaube. Waschen Sie die Bakterien noch zweimal, indem Sie sie 4 Minuten lang bei 2.000 x g bei Raumtemperatur schleudern. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in 1 ml PBS.
- Bereiten Sie die Infektionsmischung vor, indem Sie 10 oder 50 μl der in PBS resuspendierten Bakterien mit 1 ml MCDB-131 Vollmedium mischen, um eine Vielzahl von Infektionen (MOI; d.h. die Anzahl der Bakterien pro Wirtszelle) von etwa 50 Bakterien pro Wirtszelle oder 10 Bakterien pro Wirtszelle.
- Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen der 24-Well-Platten und achten Sie darauf, die Hydrogele oder die Zellen nicht zu beschädigen. Waschen Sie die Zellen 1x mit 1 mL MCDB-131 Full Medium und geben Sie dann 1 mL der Bakterien in jede Vertiefung
.
- Bewahren Sie etwas Infektionsmischung (mindestens 100 μl) für die Bestimmung des MOI auf (siehe Schritt 3.3).
- Decken Sie den Teller mit dem Deckel ab und wickeln Sie die Teller mit Polyethylenfolie ein, um ein Auslaufen zu vermeiden. Legen Sie die Platten in die Zentrifuge und drehen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 200 x g, um die Invasion zu synchronisieren. Schieben Sie die Platten in den Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie 30 min lang bei 37 °C.
- Waschen Sie die Proben 4x mit dem vollen Medium MCDB-131 und geben Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach weiteren 30 Minuten durch ein Medium, das mit 20 μg/ml Gentamicin ergänzt wurde.
- Bestimmung der Multiplizität der Infektion (MOI)
- Bereiten Sie während der anfänglichen 30-minütigen Inkubation der Wirtszellen mit den Bakterien 10-fache serielle Verdünnungen des Infektionsmixes vor, um den MOI zu bestimmen. Nehmen Sie 10-fache Verdünnungen vor, indem Sie 100 μl der Infektionsmischung mit 900 μl 1x PBS (10-1 Verdünnung) mischen. Mischen Sie dann 100 μl der 10-1-Verdünnung mit 900 μl PBS (10-2-Verdünnung).
- Fahren Sie fort, bis eine 10-5-Verdünnung erreicht ist.
HINWEIS: Alle Lösungen müssen vor dem Verdünnen gut gemischt werden, und bei jedem Schritt sollten frische, saubere Pipettenspitzen verwendet werden.
- Sobald die Verdünnungen vorgenommen sind, geben Sie 100 μl der 10-2 - 10-5 Verdünnungen auf die Mitte der BHI/Agar/Chloramphenicol/Streptomycin-Platten (falls zutreffend).
- Stellen Sie aus einer Glaspipette einen Spreizer her, indem Sie die Pipette mit Feuer zu einem Haken biegen. Tauchen Sie die Pipette zur Sterilisation in 100% Ethanol und verbrennen Sie dann das Ethanol mit einer Flamme.
- Sobald der Streuer abgekühlt ist, verteilen Sie die bakteriellen Verdünnungen homogen auf den Platten, beginnend mit der 10-5-Verdünnung und gehen Sie zu den konzentrierteren Mischungen über. Inkubieren Sie die Platten kopfüber bei 37 °C für 2 Tage.
- Bestimmen Sie je nach Koloniedichte die Anzahl der Kolonien entweder der 10-3 und 10-4 oder der 10-4 und 10-5 Verdünnungsplatten. Berechnen Sie das Trägheitsmoment wie folgt:
Anzahl der Kolonien × Verdünnungsfaktor ÷ Volumen anfänglich zugegeben = Anzahl der koloniebildenden Einheit (KBE) pro μl
Anzahl der KBE pro μl × Volumen der Bakterienmischung pro Vertiefung = Anzahl der KBE pro Vertiefung
Anzahl der KBE pro Vertiefung × Volumen der Zellen pro Vertiefung = Anzahl der Bakterien pro Zelle
HINWEIS: KBE steht für koloniebildende Einheiten.
- Mittelwerten Sie die MOIs aus zwei Platten, um die endgültigen MOIs zu erhalten.
>4. Quantitative Zeitraffermikroskopie zur Beurteilung der extrazellulären Matrixsteifigkeit
Bereiten Sie die PA-Hydrogele auf einer 24-Well-Platte vor (siehe Schritt 1), säen Sie HMEC-1-Zellen (siehe Schritt 2) und züchten Sie JAT983-Kulturen über Nacht, wie oben beschrieben (siehe Schritt 3).
- Bereiten Sie am Tag der Infektion die Infektionsmischung vor, indem Sie 10 μl Bakterienpellet pro ml MCDB-131 Full Medium mischen. Entfernen Sie das Medium vorsichtig aus den Vertiefungen der 24-Well-Platten und geben Sie 1,9 ml des vollen MCDB-131-Mediums und 0,1 ml der Bakterienmischung in jede Vertiefung.
HINWEIS: Der niedrigere MOI-Wert, der in diesem Assay verwendet wird, ist notwendig, um Verbreitungsereignisse zu analysieren, die von der Invasion einer Wirtszelle durch ein einzelnes Bakterium ausgehen.
- Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und verschließen Sie sie mit einer Plastikfolie, um ein Auslaufen zu vermeiden. Legen Sie die Platten in die Zentrifuge und drehen Sie die Proben 10 Minuten lang bei 200 x g, um die Invasion zu synchronisieren.
- Schieben Sie die Platten in den Gewebekultur-Inkubator und inkubieren Sie sie 5 Minuten lang.
- Waschen Sie die Proben 4x mit Medium und bringen Sie sie in den Gewebekultur-Inkubator. Ersetzen Sie das Medium nach weiteren 5 - 7 Minuten durch ein Medium, das mit 20 μg/ml Gentamicin ergänzt wurde.
- Inkubieren Sie die Platte für weitere 5 Stunden im Inkubator, damit sich der actA-Promotor einschalten und die Expression des offenen mTagRFP-Leserahmens steuern kann.
- Bereiten Sie ein Lebendmikroskopie-Medium vor, indem Sie L-15 von Leibovitz mit 10 % fötalem Rinderserum, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor und 1 μg/ml Hydrocortison ergänzen.
HINWEIS: Das L-15 enthält bereits 2 mM L-Glutamin, so dass es nicht notwendig ist, zusätzliches hinzuzufügen, wie im Fall von MCDB-131-Medien.
- Mischen Sie 1 μl 1 mg/ml Hoechst-Farbstoff mit 1 ml L-15-Vollmedium und geben Sie es in jede Vertiefung, um die Zellkerne zu färben. Legen Sie die Zellen für 10 Minuten in den Gewebekultur-Inkubator und ersetzen Sie dann in jeder Vertiefung das L-15-Vollmedium durch 1 ml L-15-Vollmedium, das mit 20 μg/ml Gentamicin ergänzt wird. Decken Sie die Platte mit dem Deckel ab und stellen Sie sie in die Klimakammer eines Mikroskops (siehe Materialtabelle), die auf 37 °C ausgeglichen ist.
HINWEIS: Für die Bildgebung wurde ein inverses Epifluoreszenzmikroskop mit einer CCD-Kamera (siehe Materialtabelle) und einem 20X Air Plan Fluorit-Luftobjektiv mit 0,75 NA verwendet. Die Leistung wurde auf 50% und die Belichtungszeit auf 50 ms eingestellt. Die für mCherry verwendeten Mikroskopfilter sind 470/525 nm für Anregung bzw. Emission.
- Bilde alle 5 Minuten mehrere Positionen ab, indem du eine Autofokus-Funktion verwendest, um zu überwachen, wie sich Lm durch HMEC-1-Monoschichten ausbreitet, die auf Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit ausgesät sind.
HINWEIS: L-15 ist mit HEPES gepuffert, so dass es nicht notwendig ist, während der Bildgebung CO2 zu verwenden.
Tabelle 1. Zusammensetzung von Polyacrylamid (PA)-Hydrogelen unterschiedlicher Steifigkeit. In dieser Tabelle sind der prozentuale Anteil der 40%igen Acrylamidlösung und der prozentuale Anteil der 2%igen Bis-Acrylamid-Lösung zur Erreichung einer bestimmten Steifigkeit (Elastizitätsmodul, E) in verschiedenen Spalten angegeben.
kg
kg
kg
kg
kg
kg
| Elastizitätsmodul (E, kPa) | Acrylamid % (ab 40% Lager) | Bisacrylamid % (ab 2% Lagerbestand) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
