Bestimmung der antiviralen Wirksamkeit experimenteller Arzneimittel durch einen Plaque-Assay

Zusammenfassung

Quelle: Yadavalli, T., et al. Explantation von Schweinehornhautgewebe, um die Wirksamkeit von Herpes-simplex-Virus-1 antiviralen Medikamenten zu untersuchen. J. Vis. Exp. (2021)

Dieses Video zeigt die Methode zur Durchführung eines Plaque-Assays mit einem Virus, das aus infizierter Schweinehornhaut gewonnen wurde. Die Schweinehornhaut wird verwendet, um die antivirale Wirksamkeit von experimentellen Medikamenten zu testen.

Protokoll

1. Quantifizierung von Virusinfektionen

HINWEIS: Virustiter von Schweinehornhäuten sollten jeden Tag ausgewertet werden, um die Wirkung der medikamentösen Behandlung zu analysieren.

1. Um das Virus zu quantifizieren, säen Sie Vero-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10⁵ Zellen pro Well, wenn eine 6-Well-Platte verwendet wird, wie in diesem Experiment geschehen. Tun Sie dies einen Tag vor der Infektion. Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht, um sicherzustellen, dass sie für die Virusquantifizierung zusammenfließen.
2. Aliquotieren Sie 500 μl serumfreies Medium in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen. Führen Sie einen sterilen Wattestäbchen ein, der in die serumfreien, mit Medien gefüllten Röhrchen getaucht wurde. Die Wattestäbchen müssen vor der Verwendung mindestens 5 Minuten lang getaucht und benetzt werden.
3. Transportieren Sie die infizierte Hornhautplatte des Schweins, ohne das darunter liegende Medium zu beschädigen, in eine Biosicherheitswerkstatt. Machen Sie mit den feuchten Wattestäbchen 3 Umdrehungen im Uhrzeigersinn und 3 Umdrehungen gegen den Uhrzeigersinn bei einem Durchmesser von 5 mm von der Mitte der infizierten Schweinehornhaut, ohne übermäßigen Druck auszuüben.
4. Führen Sie das Wattestäbchen wieder in das serumfreie, mit Medien gefüllte Mikrozentrifugenröhrchen ein und drehen Sie es 5 Mal im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn. Die Metallspitze des Wattestäbchens sollte kurz geschnitten werden, damit es vollständig in ein Mikrozentrifugenröhrchen passt und der Deckel geschlossen werden kann.
5. Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit dem getupften Wattestäbchen auf eine Wirbelmaschine und wirbeln Sie es 1 Minute lang bei hoher Geschwindigkeit ein.
6. Führen Sie eine Virusquantifizierung über einen Plaque-Assay an diesen Proben durch.
   Anmerkung: Dieser Quantifizierungsschritt muss an den Tagen 2, 4 und optional 6 Tage nach der Infektion durchgeführt werden.

>2. Virusquantifizierung durch Plaque-Assay

HINWEIS: Um einen Plaque-Assay durchzuführen, züchten und plattieren Sie Vero-Zellen in eine 6-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass die Zellen vor Beginn des Assays zu 90% konfluenziert sind. Es wird ein konfluenter 75 cm² Kolben dieser Zellen verwendet. Alle folgenden Schritte müssen in einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden.

1. Die konfluente Monoschicht der Vero-Zellen wird nach dem Aspirieren des Kulturmediums mit 10 ml frischer Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) im Kolben gewaschen. Wiederholen Sie den Waschschritt erneut mit PBS, nachdem Sie den ersten Satz Waschlösungen abgesaugt haben.
2. Geben Sie 1 ml 0,05% Trypsin in die Zellmonoschicht. Den Kolben bei 37 °C 5 Min. inkubieren. Mit bloßem Auge ist darauf zu achten, dass sich die Zellen von der Innenfläche des Kolbens lösen. Wenn nicht, warten Sie weitere 5 Minuten, bevor Sie den Kolben erneut untersuchen. Wenn Zellen abgelöst zu sein scheinen, geben Sie 9 ml des ganzen Mediums in die Monoschicht, um sicherzustellen, dass sich die Zellen vollständig von der Kolbenoberfläche lösen.
3. Alle Zellen werden zusammen mit dem gesamten Medium aus dem Kolben entnommen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen gegeben.
4. Verwenden Sie für jede Vertiefung der 6-Well-Platten, die für den Plaque-Assay verwendet werden, 300 μl aus dem Zentrifugenröhrchen. Füllen Sie jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit 2 ml ganzem Medium auf. Lassen Sie die Platten über Nacht im Inkubator, damit sie wachsen und in jeder Vertiefung eine konfluente Monoschicht bilden können.
5. Um einen Plaque-Assay durchführen zu können, muss vor der Quantifizierung des Virus eine serielle Verdünnung der Proben durchgeführt werden.
6. Führen Sie eine log101-fache Verdünnung des Virus in Mikrozentrifugenröhrchen mit serumfreien Medien durch, bis eine Verdünnung von ^10-8 erreicht ist. Wenn bei einer ^{10-3-Verdünnung} 1 ml der Verdünnung auf die Monoschicht der plattierten Zellen übertragen wird, nachdem das Wachstumsmedium von der 6-Well-Platte auf die Zellen abgesaugt wurde, ist dies der Infektionsschritt. Inkubieren Sie die infizierte Platte bei 37 °C Inkubator für 2 h.
7. Aspirieren Sie das vorhandene Infektionsmedium, waschen Sie es zweimal vorsichtig mit PBS, um die Zellen zu beschichten, und geben Sie 2 ml Methylcellulose-beladenes Medium pro Vertiefung in alle 6 Vertiefungen. Inkubieren Sie 72 Stunden lang oder bis die Bildung von Plaques sichtbar ist. Plaques können durch die Bildung kleiner Lücken zwischen den Zellen in der Zellmonoschicht identifiziert werden.
8. Geben Sie langsam 1 ml Methanol in die Ecke jeder Vertiefung und verwenden Sie dabei die Wand als Orientierungsspitze. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Inhalt jeder Vertiefung langsam aus der Platte ab, ohne die Zellmonoschicht zu stören oder zu bewegen.
9. Geben Sie 1 ml Kristallviolett-Arbeitslösung in jede Vertiefung der 6-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass alle Zellen bedeckt sind. Inkubieren Sie die 6-Well-Platte 30 Minuten lang im Dunkeln. Entsorgen Sie die kristallviolette Lösung, indem Sie sie einatmen, und trocknen Sie die Vertiefungen auf einem Blatt saugfähigem Papier.
10. Zählen Sie die Anzahl der Plaques in der Vertiefung mit der höchsten Verdünnung, um den Gesamtvirusgehalt in der Ausgangslösung zu quantifizieren. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal, um den Virustiter zu bestätigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
30 G Injektionsnadeln.	Bd	305128
500 mL Glasflasche.	Thomas Wissenschaftlich	844027
Biosicherheitswerkbank mit Bio-Safety Level-2 (BSL-2) Zertifizierung.	Thermofisher Scientific	Herasafe 2030i
Calgiswab 6" sterile Calciumalginat-Standardtupfer.	Puritaner	22029501
Zellschaber - 25 cm	Biologix BE	Tel.: 70-1180, 70-1250
Zentrifugenröhrchen
Kristallviolett	Sigma Aldrich	Nr. C6158	Lagern Sie das Pulver an einem dunklen Ort
Dulbecco's modifizierte Eagle's Medium - DMEM	GIBCO	41966029	Bis zur Verwendung bei 4 °C lagern
Ethanol	Sigma Aldrich	Nr. E7023
Fötales Rinderserum -FBS	Sigma Aldrich	Nr. F2442	Aliquot in 50-ml-Röhrchen geben und bis zur Verwendung eingefroren aufbewahren
Vero-Zellen	American Type Culture Collection ATCC	CRL-1586
Vortex-Maschine
Methanol
Methylcellulose
Mikrozentrifugenröhrchen
Schweine-Hornhäute	Park Packaging Co., Chicago, Illinois		Sonderbestellung auf Anfrage
Abdeckungen der Behandlungsbank - je nach Bedarf.	Thermofisher Scientific	Nr. S42400
Serologische Pipetten	Thomas Wissenschaftlich	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Serologische Pipettiergeräte.	Thomas Wissenschaftlich	Ezpette Pro
Stereoskop	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Gewebekulturflaschen, T175 cm2.	Thomas Wissenschaftlich	Nr. T1275
Gewebekultur-Inkubatoren, die eine Temperatur von 5 % CO2 und 37 °C aufrechterhalten können	Thermofisher Scientific	Forma 50145523
Mit Gewebekulturen behandelte Platten (6-Well).	Thomas Wissenschaftlich	Nr. T1006
Trypsin