>1. HSV-Dehnungen und Handhabung
HINWEIS: Für den Assay wird rekombinantes, nicht spreizendes HSV-1(KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ- mit Beta-Galactosidase-Reporteraktivität verwendet.
- Verwenden Sie das Virus aus einer einzigen Charge und lagern Sie es bei -80 °C im Verhältnis 1:1 von Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 20 % fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor der Lagerung der Viruscharge ist die Viruskonzentration durch o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid (ONPG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal)-Assay zu bestimmen.
- Bestimmen Sie die Virusviabilität und die Multiplizität der Infektion (MOI) durch X-Gal-Färbung für jeden experimentellen Assay unter Verwendung eines Reportervirus-Entry-Assays, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1).
- Verdünnen Sie das Virus (Opt-MEM) auf das gewünschte MOI. Fixieren Sie die Monoschichten (Paraformaldehyd; 0,5 ml/Well) vor dem Färben. Platzieren Sie die Virusviabilitätskontrollen in einer separaten Mikrotiterplatte parallel zu den polymikrobiellen Assayplatten.
>2. Handhabung von HeLa 299-Zellen
- Anbau bei 37 °C, 5 % CO2 in DMEM mit 4,5 g/l Glukose, 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), Gentamicin (50 μg/ml) und L-Glutamin. Passagezellen bei 80%iger Konfluenz mit Trypsinlösung (Ethylendiamintetraessigsäure, 0,53 M EDTA; 0,05 % Trypsin; 5 ml/Kolben).
>3. Umgang mit C. albicans
HINWEIS: C. albicans, gewonnen aus einer klinischen Laborquelle, wird bei -80 °C in Remmel Magermilch 2x Medium gelagert.
- Kultivieren Sie gefrorenen Bestand auf Sabouraud Dextrose Medium (37 °C). Nach 24 h Subkultur den C. albicans zur Verwendung auf Fungiselmedium (37 °C; 48 h) auffüllen.
- Erzeugung von Keimröhrenformen (GT) (Auswahl repräsentativer Kolonien; 3 ml FBS; 3 Std.; 37 °C; Extinktion600 (Abs600), 0,3). Nach der Inkubation GT (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS; 2x; 4.000 x g) waschen. Gewaschenes GT zu erwärmtem HBSS (37 °C; 0,32 Abs600) geben. GT-Formen sollten 99 % der beobachteten Zellen ausmachen, die durch Hämozytometerzahl bestimmt werden.
- Herstellung von Hefe-Stammsuspensionen (YF) durch Auswahl repräsentativer Fungisel-Kolonien (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs600). Zählen Sie die Anzahl der YF-Formen/ml mikroskopisch mit einem Hämozytometer. YF-Formen sollten 99 % der beobachteten Zellen ausmachen, die durch die Hämozytometerzahl bestimmt werden.
- Herstellung von funktionsfähiger Pilzbrühe (250 μl GT- oder YF-Stamm in 25 ml HBSS; 37 °C; 105 koloniebildende Einheit, (KBE/ml)
>4. Umgang mit S. aureus
- Store S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C; Remmel Magermilch 2x). Kultur auf Schafblut-Agar (5%; 37 °C; 24 h). Repräsentative Kolonien auswählen und innerhalb von 2 Tagen (37 °C; 18 Stunden) in Mannitolsalzmedium umfüllen.
- Make S. aureus Stammsuspension (3 ml HBSS; 1,32 Abs600 ;108 KBE/ml)
- S. aureus-Stamm zum Arbeiten herstellen (100 μl des Stoffes in 25 ml HBSS; 105 KBE/ml).
>5. Candida- und S. aureus-Suspensionen
- Gemischte C. albicans- und S. aureus-Suspension herstellen (250 μl YF- oder GT-Stamm und 100 μl S. aureus-Stamm in 25 ml HBSS).
>6. Polymikrobieller Biofilm-Assay
- 96-Well-Platten mit 200 μl von 2 x 105 HeLa-Zellen/ml (85 % Konfluenzniveau) bestücken. Gesteinsplatten (30 - 45 min; 37 °C) vor der Inkubation (37 °C; 5 % CO2 -Inkubator; 18 h). Waschen Sie Monolagen (1x; Opt-MEM) und dann mit HSV (HSV-1 (KOS) gL86 oder HSV-2 (KOS) 33 gJ- in 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 und 10). Platten inkubieren (3 Std.; 37 °C; 5 % CO2). Verwenden Sie nur einen Virusstamm pro Tag.
- Infizierte Monoschichten (1x; phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)) mit Mg+2 und Ca+2; 100 μl) waschen. Ersetzen Sie PBS durch warmes HBSS und lassen Sie 25 μl in jeder Vertiefung.
- YF, GT und/oder S. aureus Arbeitssuspensionen (100 μl; Ziel-Zell-Verhältnis = 5:1; n = 16) wie in Tabelle 1 angegeben zugeben. Platten inkubieren (statisch; 30 min; 37 °C; 5 % CO2).
- Nach der Inkubation wird eine Säule nach der anderen aspiriert und sofort mit 300 μl PBS mit Mg+2 und Ca+2 nachgefüllt. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal, und fügen Sie dann einen Radioimmunpräzipitationsassay und einen Lysepuffer (RIPA; Filter sterilisiert; 200 μl einer Verdünnung von 1:50) hinzu.
- Das HeLa-Zelllysat wird schnell verzerrt und dann 50 μl auf Mannitolsalze (MS) und/oder Fungisel (F) aufgetragen (Abbildung 2). Verteilen Sie das Lysat mit einem Glasstab, der in einem 90°-Winkel gebogen ist. Inkubieren Sie die Platten (18 Std. bei 37 °C). Zählen Sie manuell die Anzahl der Völker pro Platte. Die Kontrollen bestehen aus S. aureus- und/oder C. albicans-Adhärenz an HSV-nicht infizierten HeLa-Zellen.
Tabelle 1. Allgemeine Template-Bestimmung der mikrobiellen Adhärenz in polymikrobiellen Interaktionen.GT= Phänotyp des Keimschlauchs Candida albicans; YF= Phänotyp der C. albicans-Hefeform; MSSA= Methicillin-empfindlicher Staphylococcus aureus; MS= Mannitolsalze Mittel; F= Fungisel-Medium.
