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>1. Lösungen und Medien
- Bereiten Sie 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium, phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Sabouraud-Dextrosebrühe und Sabouraud-Dextrose-Agar gemäß Tabelle 1 vor.
>2. Wachstumsbedingungen des Pilzinokulums
- Lagern Sie alle Pilzstämme als gefrorene Brühen in 35%igem Glycerin bei -80 °C, bis sie benötigt werden.
- Führen Sie vor jedem Experiment die folgenden Schritte aus.
- Für Candida albicans-Stämme:
- Tauen Sie ein Vorratsfläschchen auf und geben Sie 200 μl bis 10 ml Sabouraud Dextrosebrühe in ein steriles 50-ml-Polypropylenröhrchen mit Kappe und Kultur über Nacht bei 30 °C unter Rühren (200 U/min). Denken Sie daran, das Röhrchen zu neigen und die Kappe leicht geöffnet zu lassen, um die Kultur besser zu belüften.
- Für Cryptococcus neoformans-Stämme:
- Kratzen Sie die gefrorene Oberfläche eines Vorratsfläschchens ab. Die Zellen auf Sabouraud-Dextrose-Agarplatten aufplättieren und 48 h bei 30 °C inkubieren. Nach sichtbarem Wachstum isolierter Kolonien die Platten bis zu 15 Tage im Kühlschrank (4 °C) mit Paraffinfolie verschlossen aufbewahren.
- Entnehmen Sie eine mittelgroße isolierte Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer sterilen Impföse von der Platte und impfen Sie 10 ml Sabouraud-Dextrosebrühe in ein steriles konisches 50-ml-Röhrchen. Ca. 24 h bei 30 °C unter Rühren (200 U/min) inkubieren.
- Überschreiten Sie nicht die Inkubationszeit von 24 Stunden. Denken Sie daran, das Rohr zu neigen und die Kappe für eine bessere Belüftung leicht geöffnet zu lassen. Es ist immer gut, das Wachstumsstadium der Zellen vor jedem Test zu standardisieren, da dies ein wichtiger Faktor ist, der die Antibiotikaresistenz beeinflusst.
Anmerkung: Beide Pilze wurden in unseren Experimenten bei 30 °C gezüchtet, um eine schnelle Vermehrung zu gewährleisten, aber die Temperatur kann geändert werden, um die Ziele der Studie widerzuspiegeln, z. B. die klinische Behandlung (37 °C). Am wichtigsten ist, dass diese anfängliche Inkubationszeit für jedes Pilzisolat im Voraus festgelegt und während aller Tests beibehalten wird, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten.
- Nach dem Pilzwachstum sammeln Sie die Zellen, indem Sie die konischen Röhrchen bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und fügen Sie 10 ml PBS hinzu.
- Die Zellen resuspendieren und erneut bei 1.200 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
- Wiederholen Sie die PBS-Spülung und Zentrifugation noch zweimal. Nach der dritten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml (je nach Pelletgröße) mit 2X RPMI-1640 Medium.
- Bereiten Sie 1 ml einer Verdünnung im Maßstab 1:100 oder 1:1.000 in einem Mikrozentrifugenröhrchen vor (abhängig von der Trübung der Zellsuspension).
- Aliquotieren Sie 10 μl dieser Verdünnung, geben Sie es in eine Hämozytometerkammer und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in den vier Eckquadranten unter dem Mikroskop. Berechnen Sie die Konzentration nach folgender Formel: (Gesamtzellzahl/4) x Verdünnungsfaktor x 104 (Kammerverdünnungskonstante).
- Eine 100%ige Lebensfähigkeit ist in Betracht zu ziehen, wenn die Viabilität zählt und die Wachstumsbedingungen für das untersuchte Isolat systematisch korreliert wurden.
Anmerkung: Die Standardisierung und Qualitätskontrolle der Viabilitätszahlen kann durch Rückseitenbeschichtung gemäß der antimykotischen MIC-Methode (Minimum Inhibitory Concentration) des Europäischen Komitees für antimikrobielle Empfindlichkeitstests (EUCAST) für Hefen erfolgen.
- Wenn die Korrelation zwischen Wachstum und Lebensfähigkeit für das untersuchte Isolat nicht festgestellt wurde, messen Sie die Lebensfähigkeit des Pilzes, indem Sie lebende Zellen in einem Hämozytometer mit Hilfe von Farbstoffen zählen, die tote Zellen selektiv färben, wie z. B. Phloxin B11, Trypanblau oder Janusgrün. Verwenden Sie die Pilzzellen für dieses Protokoll nur, wenn die Lebensfähigkeit der Population zu diesem Zeitpunkt 90 % oder mehr beträgt.
HINWEIS: Tote/lebendige Farbstoffe funktionieren möglicherweise nicht gut mit dem Pilz der Wahl. Bitte testen Sie diese vor der Anwendung. Zum Beispiel funktioniert der Farbstoff Trypanblau nicht gut mit C. neoformans.
- Bereiten Sie danach die Zellsuspensionen in 2X RPMI-1640 Medium (2X angepasstes Inokulum in RPMI-1640 Medium) vor. Für 96-Well-Platten ist ein Volumen von 5 ml pro Platte in Betracht zu ziehen.
- Für alle C. albicans-Stämme ist eine Stammzellsuspension von 4 x 103 Zellen/ml herzustellen. Diese Konzentration beträgt das 2-fache der endgültigen Zellkonzentration in jeder Vertiefung (2 x 103 Zellen/ml).
- Für C. neoformans-Stämme ist eine Stammkultur mit Zellen von 2 x 104 Zellen/ml vorzubereiten. Diese Konzentration ist doppelt so hoch wie die endgültige Zellkonzentration in jeder Vertiefung (1 x 104 Zellen/ml).
- Bei anderen Pilzen ist mit einem bekannten Antimykotikum zu testen, welche Konzentration für die jeweilige Studie in Bezug auf die Inkubationszeit ideal ist. Berücksichtigen Sie den Stoffwechsel und die Verdopplungszeit des Pilzes.
>3. Peptide (unbekannter Wirkstoff)
- Lagern Sie die lyophilisierten Peptide bei -20 °C und lösen Sie sie vor jedem Experiment in deionisiertem Wasser auf. Die maximale Lagerzeit nach dem Auflösen in Wasser hängt von der Art des jeweiligen Peptids ab.
- Bereiten Sie Aliquots mit dem Doppelten der höchsten im Assay getesteten Endkonzentration (2X) vor. Idealerweise bereiten Sie eine kleine Anzahl von Aliquoten mit genügend Peptid für den einmaligen Gebrauch vor, um Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden.
Anmerkung: Die Wahl der Konzentration sollte auf der Literatur und den Eigenschaften des Peptids basieren. Es wird empfohlen, die seriellen Verdünnungen mit etwa 100 μM des Peptids zu beginnen und dann diesen Konzentrationsbereich abhängig von den erzielten Ergebnissen zu verringern oder zu erhöhen.
>4. Referenz-Antimykotika (Positivkontrollen)
- Für in Wasser verdünnte Präparate: Bereiten Sie eine 2-fache Lösung mit der höchsten Konzentration der Analyse vor (siehe Abschnitt 5: Antimykotischer Assay für die Verdünnungsschritte).
- Für C. albicans-Stämme ist eine Lösung von 128 μg/ml Fluconazol oder 128 μg/ml Caspofungin herzustellen. Die Plattenkonzentration für beide beträgt 64 μg/ml.
- Für C. neoformans-Stämme ist eine Lösung von 32 μg/ml Amphotericin B (wasserlösliche Lösung) herzustellen. Die Plattenkonzentration beträgt 16 μg/ml.
HINWEIS: Normalerweise wird Amphotericin B in Dimethylsulfoxid (DMSO) verdünnt, da dieses Antimykotikum schwer wasserlöslich ist. Es gibt jedoch wasserlösliche Amphotericin B-Präparate, die im Handel erhältlich sind.
- Für Antimykotika, die in einem organischen Lösungsmittel verdünnt sind: Bereiten Sie eine 100-fache Stammlösung in DMSO vor und verdünnen Sie sie dann zur Verwendung auf das 10-fache in Wasser.
Anmerkung: Somit wird die Endkonzentration von DMSO in der Vertiefung 1% nicht überschreiten. Ein Brunnen, in dem der Pilz in Medien mit 1 % DMSO wächst, da eine Bekämpfung erforderlich ist, da einige Pilze diese Konzentration des Lösungsmittels nicht gut vertragen. Denken Sie daran, dass DMSO lichtempfindlich ist, also decken Sie die Platte mit Folie ab oder legen Sie sie für die Dauer der Inkubationszeit in eine dunkle Kammer.
>5. Antimykotischer Assay
HINWEIS: In-vitro-Antimykotika-Assays werden auf der Grundlage des Bouillon-Mikrodilutions-Empfindlichkeitstests aus den M27-A3-Richtlinien des Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) mit einigen Änderungen durchgeführt.
- Bereiten Sie eine zweifache serielle Verdünnung jedes Peptids vor und kontrollieren Sie das Antimykotikum in 96-Well-Polystyrol-Mikrotiterplatten auf ein Endvolumen von 50 μl.
- Mit einer Pipette 100 μl des Antimykotikums/Peptids in der 2-fachen Konzentration der höchsten gewünschten Endkonzentration in den Spalten 1-3 in Reihe A zugeben.
- Geben Sie mit einer Mehrkanalpipette 50 μl steriles Wasser in die anderen Vertiefungen in den Reihen B bis H.
- 50 μl der Vertiefungen mit der höchsten Konzentration (Reihe A) entfernen, in die nächste Vertiefung mit der nächsten Konzentration (Reihe B) überführen und homogenisieren.
- Wiederholen Sie die obigen Schritte bis zur Vertiefung mit der niedrigsten Konzentration und verwerfen Sie 50 μl dieser Vertiefung (Reihe H). In den Spalten 11 und 12 (Zeilen A, B, C) wird nur Wasser für die Blind- oder Negativ-/Wachstumskontrolle verwendet.
- Geben Sie 50 μl des 2-fach angepassten Inokulums in RPMI-1640-Medium in jede Vertiefung (Spalten 1-3 plus Spalte 11 (Negativ-/Wachstumskontrolle)); die Endkonzentration für C. albicans beträgt 2 x 103 Zellen/ml und die Endkonzentration für C. neoformans-Stämme 104 Zellen/ml.
- Bereiten Sie Blindkontrollen (50 μl Wasser + 50 μl 2X RPMI-1640 Medium ohne Zellen) und Negativ-/Wachstumskontrolle (50 μl Wasser + 50 μl angepasstes Inokulum 2X RPMI-1640 Medium ohne Antimykotikum) vor und laden Sie es wie oben beschrieben in die Well-Platte.
- Wiederholen Sie das Verfahren für jede zu prüfende Verbindung und die gewählte antimykotische Kontrolle (Spalten 4-10).
Anmerkung: Die seriellen Verdünnungen können vertikal wie im Experiment unten oder horizontal in der Platte durchgeführt werden (d. h. wenn die Anzahl der Verdünnungen der gegebenen Verbindung/des Extrakts, die getestet werden müssen, acht oder mehr beträgt).
- Wenn die Verbindungen, Referenzarzneimittel oder einer ihrer Bestandteile lichtempfindlich sind, führen Sie den Assay bei reduziertem Licht durch, decken Sie die Platten mit Folie ab oder legen Sie sie während der Inkubation in eine dunkle Kammer.
- Beachten Sie die folgenden optionalen Empfehlungen.
- Versiegeln Sie die Platte mit einer durchsichtigen Abdeckplatte, die einen Gasaustausch ermöglicht, da dies zur Verringerung der Verdunstung beiträgt.
- Stellen Sie die Platte in eine feuchte Kammer; das hilft auch, die Verdunstung zu reduzieren.
- Die Platten werden bei 37 °C für 24 h bzw. 48 h für alle C. albicans-Stämme und für 48 h bei 200 U/min Schütteln für C. neoformans inkubiert. Das geringere Endvolumen (100 μL) stellt sicher, dass kein Spillover auftritt.
Anmerkung: Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den MHK-Messwerten nach 24 h und 48 h für C. albicans-Stämme beobachtet. Nichtsdestotrotz sind Messwerte bei 48 h leichter zu visualisieren.
- Alle Vertiefungen werden mit Hilfe eines inversen Lichtmikroskops vor und nach der Inkubationszeit beobachtet, um Veränderungen in der Morphologie sowie auf Anzeichen von Kontaminationen zu überprüfen.
Anmerkung: Messungen können visuell durchgeführt und am Ende des Experiments fotografiert werden. Vor jedem Ablesen die Platte leicht homogenisieren. Die Reads können auch durch Messung des Außendurchmessers bei 600 nm durchgeführt werden, wenn keine Zellklumpen oder Filamentation beobachtet werden.
- Führen Sie die Experimente mindestens dreimal an unterschiedlichen Terminen durch.
Tabelle 1. Vorbereitung von Medien und Reagenzien.
| Mittel | Präparat |
| >2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mittel – 500 mL | 10,4 g RPMI-1640 (ergänzt mit L-Glutamin und Phenolrot; ohne Bicarbonat) |
| 330 mM 3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS) |
| Mit NaOH auf pH 7,0 einstellen |
| Sterilisieren durch Filtration (0,22 μM Filter) |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | 137 mM NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM Na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| 15 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren. |
| Sabouraud Dextrosebrühe | 15 g des Pulvers in 500 mL destilliertem Wasser. |
| Mit NaOH auf pH 7,0 einstellen |
| 15 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren. |
| Sabouraud Dextrose Agar | 32,5 g des Pulvers in 500 mL destilliertem Wasser. |
| Mit NaOH auf pH 7,0 einstellen |
| 15 Minuten lang bei 121 °C autoklavieren. |