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>1. Quantifizierung der Lebensfähigkeit von GC-Aggregationen
- Sammeln Sie GC mit einem sterilen Applikator. Tupfen Sie GC von der Platte ab und suspendieren Sie GC in vorgewärmter Brühe (GCP, Tabelle 1), ergänzt mit 4,2 % NaHCO3 und 1 % Kellogg-Lösungen. Verwenden Sie Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm (ein OD 650 von 1 = ~1 x 109 KBE/ml), um die Konzentration suspendierter Bakterien zu bestimmen.
- Die Konzentration der GC auf ~1 x 108 KBE/ml einstellen.
- Geben Sie 99 μl angepasste GC-Suspension in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
- Die Platte wird 6 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert, damit sich die Bakterien vermehren können.
- Geben Sie 1 μl seriell verdünntes Ceftriaxon (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/ml) in jede Vertiefung. Lassen Sie einige Vertiefungen unbehandelt, die als Kontrollen dienen.
- Die Platte wird 24 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Die Suspension wird in jeder Vertiefung 3 Mal für 5 s bei 144 W und 20 kHz besondigt.
- Geben Sie 100 μl handelsübliches ATP-Verwertungs-Glühreagenz in jede Vertiefung, pipettieren Sie 3 Mal auf und ab und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Übertragen Sie vorsichtig 150 μl Mischung aus jeder Vertiefung in eine neue Vertiefung in einer schwarzen 96-Well-Mikroplatte und vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Messen Sie die Extinktion jeder Vertiefung bei 560 nm mit dem Plattenleser.
- Berechnen Sie die Überlebensrate anhand des Verhältnisses des Messwerts, der nach einer seriellen Ceftriaxon-Behandlung erhalten wurde, zu dem Messwert aus unbehandelten Vertiefungen.
2. Fluoreszenzmikroskopische Analyse von lebenden/toten GC-Aggregaten
- Sammeln Sie GC mit einem sterilen Applikator. Tupfen Sie GC von der Platte ab und suspendieren Sie GC in vorgewärmten GCP-Medien plus 1 % Kellogg-Nahrungsergänzungsmitteln.
- Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien durch Spektrophotometrie bei einer Wellenlänge von 650 nm und stellen Sie die Konzentration der GC auf ~1 x 107 KBE/ml ein.
- 198 μl GC-Suspension in eine 8-Well-Deckglaskammer geben.
- Die Kammer wird 6 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert, um die Aggregationsbildung zu ermöglichen.
- Geben Sie 2 μl Ceftriaxon (100 μg/ml oder verschiedene Verdünnungen) in jede Vertiefung innerhalb jeder Aggregationsbedingung. Inkubieren Sie für die gewünschte Zeit bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Geben Sie 0,6 μl Lebend-/Totfärbelösungsgemisch in jede Vertiefung und inkubieren Sie 20 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO2.
- Erfassen Sie Bilder der Z-Serie mit einem konfokalen Mikroskop (ein gleichwertiges Mikroskop kann verwendet werden).
- Analysieren Sie die Bilder mit der ImageJ-Software zur Messung der Größe von GC-Aggregaten und des Fluoreszenzintensitätsverhältnisses FIR von Lebend- zu Totfärbung in jedem Aggregat.
Tabelle 1: Rezept für 1 l GCP Bakterienwachstumsmedium.
