Bestimmung der Rolle neutrophilenähnlicher Zellen bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber einem Testmedikament

Zusammenfassung

Quelle: Hirz, T., et al. Isolierung und Analyse von Neutrophilen zur Bestimmung ihrer Rolle bei der Empfindlichkeit von Lymphomzellen gegenüber therapeutischen Wirkstoffen. J. Vis. Exp. (2016).

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Rolle von neutrophilenähnlichen Zellen beim Schutz von Lymphomzellen vor der Zytotoxizität von Chemotherapeutika untersucht. Eine 3D-Co-Kultur, bestehend aus Lymphom- und neutrophilenähnlichen Zellen, wird etabliert und mit Vincristin – einem Chemotherapeutikum – belichtet. Der direkte Kontakt mit den neutrophilenähnlichen Zellen induziert eine Hochregulierung der anti-apoptotischen Proteine in den Lymphomzellen und fördert dadurch deren Überleben in Gegenwart von Vincristin.

Protokoll

>1. Differenzierung von HL60-Zellen entlang des granulozytären Weges und ihre Kokultur mit RL-Lymphom-B-Zellen im 3D-Modell

1. Differenzierung von humanen promyelozytären (HL60) Zellen in neutrophilenähnliche Zellen
   1. Passen Sie die HL60-Zellzahl auf 3 x 10⁵ Zellen/ml an und fügen Sie dann 1 μM Retinsäure (RA) und 1,25 % DMSO hinzu, um ihre Differenzierung zu induzieren. Säen Sie jeweils 3 x 10⁵ HL60-Zellen pro Vertiefung in einer 48-Well-Platte aus und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 °C mit 5 % CO₂.
   2. Später sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 300 g bei RT. Resuspendieren Sie die Zellen mit vollständigem RPMI-Medium für die Zählung mit dem Zellviabilitätszähler.
   3. Dann verdünnen Sie die Zellsuspension in vollständigem RPMI-Medium, um die HL60-Zellzahl auf 3 x 10⁵ Zellen/ml einzustellen, und induzieren Sie ihre Differenzierung erneut durch Zugabe von 1 μM Retinsäure (RA) und 1,25 % Dimethylsulfoxid (DMSO). Je 3 x 10⁵ HL60-Zellen pro Well in eine 48-Well-Platte aussäen und weitere 48 Stunden bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubieren.
2. Analyse der HL60-Differenzierung (HL60-Diff)
   1. Sammeln Sie die Zellen und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 5 Minuten bei RT. Resuspendieren Sie das Pellet mit vollständigem Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) zur Zählung mit dem Zellviabilitätszähler
   .
   2. Analyse der Veränderungen in der Expression von Zelloberflächenmarkern mittels Durchflusszytometrie. Legen Sie je 3 x 10⁵ undifferenzierte HL60-Zellen (aus Zellkultur) und 3 x 10⁵ HL60-Diff-Zellen in 5-ml-Kunststoffröhrchen für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
   3. Resuspendieren Sie die Pellets in 50 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)-fötalem Rinderserum (FBS) (4%). Markieren Sie die Zellen mit anti-humanem CD11b, konjugiert an AF700, oder anti-humanem CD38, konjugiert an APC (5 μl/10,⁶ Zellen). Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang dunkel bei 4 ^°C.
   4. Mit 500 μl PBS-FBS (4%) waschen, dann bei 300 g für 5 min bei RT zentrifugieren. Die Pellets in 200 μl PBS-FBS (4%) resuspendieren.
   5. Analysieren Sie auf einem Durchflusszytometer mit der Gating-Strategie in Abbildung 1A und der folgenden optischen Konfiguration: 488-nm-Laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Um die morphologischen Veränderungen in HL60diff zu testen, immobilisieren Sie die Zellen für die mikroskopische Untersuchung auf Objektträgern.
      1. Dazu werden je 3 x 10⁴ undifferenzierte HL60-Zellen (aus Zellkultur) und 3 x 10⁴ HL60diff in 150 μl vollständigem RPMI-Medium resuspendiert. Montieren Sie die Objektträger, Filterkarten und Probenkammern in der Cytospin-Zentrifuge und stellen Sie sicher, dass die Zentrifuge ausbalanciert ist.
      2. Legen Sie jeden Zelltyp in die Probenkammer und die Zytozentrifuge bei 1.500 U/min für 10 Minuten bei RT. Entfernen Sie die Objektträger, Filterkarten und Probenkammern aus der Zentrifuge. Vorsichtig zerlegen, um die Zellen auf dem Objektträger nicht zu beschädigen. Entsorgen Sie Filterkarten und Probenkammern.
      3. Färben Sie die Zellen mit dem Giemsa-Färbekit und lassen Sie die Objektträger 1 Stunde lang trocknen. Untersuchen Sie die Zellen unter dem Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung.
3. 3-dimensionale (3D) Kultur
   Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die in diesem Experiment verwendeten Materialien kalt sind und das Experiment auf Eis stattfindet.
   1. Resuspendieren Sie je 5 x 10⁴ RL-Zellen, entweder allein oder gemischt mit HL60diff im Verhältnis RL:HL60diff 1:10, mit 300 μl Basalmembranmatrix unter Verwendung von 1 ml Pipettenspitze, die mit einer sterilen Schere geschnitten wird, um die Öffnung auf ca. 2 bis 3 mm zu erweitern. Vermeiden Sie Blasenbildung während dieses Schritts.
   2. Je 300 μl Zellsuspension/Vertiefung in eine 24-Well-Platte aussäen. Vermeiden Sie Blasen während dieses Schritts. Die Platte wird 30 Minuten lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert, dann 1 ml vollständiges RPMI-Medium für jede Vertiefung hinzugefügt und 7 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Wechseln Sie das Medium alle zwei Tage. Fügen Sie 10 nM Vincristin an Tag 5 hinzu.
4. FACS-Analyse
   1. Nach 7 Tagen Kultur das Medium aspirieren und jede Vertiefung zweimal mit 1 ml eiskaltem PBS waschen. 3 ml/Well eiskalte PBS-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (5 mM) zugeben. Lösen Sie das Gel vom Boden der Vertiefung, indem Sie es mit der Unterseite der 200-μl-Pipettenspitze abkratzen. Den Teller 30 min lang leicht auf Eis schütteln.
   2. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein steriles 15-ml-Röhrchen und schütteln Sie die Röhrchen weitere 30 Minuten lang vorsichtig auf Eis. Überprüfen Sie, ob eine homogene Zellsuspension vorhanden ist. (Wenn dies nicht der Fall ist, schütteln Sie die Zellen für längere Zeit oder fügen Sie mehr PBS-EDTA hinzu).
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 x g für 10 min bei RT. Waschen Sie die Pellets mit PBS und zentrifugieren Sie dann bei 300 x g für 10 min bei RT.
   4. Resuspendieren Sie mit PBS-FBS (4%) und markieren Sie mit einem Anti-Human-CD19-Antikörper, der an PE-Cy7 konjugiert ist, und einem Anti-Human-CD38-Antikörper, der an APC konjugiert ist (5 μl/10,⁶ Zellen). 30 min dunkel bei 4 ^°C inkubieren.
   5. Waschen Sie mit 500 μl PBS-FBS (4%) und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie die Zellen mit Annexin V und PI mit einem handelsüblichen Kit.
   6. Die Analyse erfolgt auf einem Durchflusszytometer unter Verwendung der Gating-Strategie in Abbildung 2A und der folgenden optischen Konfiguration: 488-nm-Laser: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10 BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); 633-nm-Laser: APC (660/20 BP). Stellen Sie die Farbkompensation sicher.

Ergebnisse

Abbildung 1. Strukturelle Parameter differenzierter HL60-Zellen. (A) Vorwärtsstreudiagramme (FSC) und Seitenstreudiagramme (SSC) repräsentieren HL60- und differenzierte HL60-Zellen (HL60-Diff). (B) HL60- und HL60-Diff-Zellen wurden mit Anti-CD11b-AF700 oder Anti-CD38-APC markiert, gefolgt von einer Durchflusszytometrie-Analyse. Nach dem Gating je...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
RPMI 1640	Gibco Invitrogen	Artikel-Nr.: 21875-034
Fötales Rinderserum (FBS)	Gibco Invitrogen	Nr. 10270-106
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS enthält Calcium und Magnesium)	Gibco Invitrogen	Artikel-Nr.: 14040-091
Vincristin	EG labo
BD Matrigel Basalmembran-Matrix	BD Biowissenschaften	354234	Über Nacht vor dem Tag des Versuchs auf 4 oC stellen
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma-Aldrich	Nr. D8418
Retinsäure	Sigma-Aldrich	Nr. R2625
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	Nr. A7906
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E5134
Anfügendes V-FLOUS-Färbeset	Roche	11 988 549 001
Kit RAL 555 Modifiziertes Giemsa Färbeset	Kosmos Biomedizin	CB361550-0000
LSRII-Durchflusszytometrie	BD Biowissenschaften
Zytozentrifuge	Thermo Scientific
Leica DMR-XA Mikroskop	Leica Mikrosysteme
Cellometer Auto T4 Zellviabilitätszähler	Nexcelom Biowissenschaften