Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Inokulation von C57BL/6 Mäusen mit T Ag-exprimierenden Tumorzellen
- Die SV40-transformierte Fibrosarkom-Zelllinie C57SV (oder eine ähnliche T-Ag+-adhärente Zelllinie) wird in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g/l D-Glucose und L-Glutamin (1x) gezüchtet und mit 1 mM Natriumpyruvat und 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) in mit Gewebekulturen behandelten Kolben bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre mit 10 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt.
- Sobald die Zellen vollständig konfluent oder leicht überkonfluent sind, entfernen und verwerfen Sie das Medium vorsichtig und spülen Sie die Monoschicht mit vorgewärmter steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) aus.
HINWEIS: Die maximale T-Ag-Expression wird erreicht, wenn die T-Ag+-Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen.
- In einer biologischen Sicherheitswerkbank wird vorgewärmte Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (Trypsin-EDTA) (0,25 %) hinzugefügt, um die Monoschicht bei Raumtemperatur zu bedecken, bis die Zellen in Flecken abgelöst werden. Klopfen Sie mehrmals auf die Seiten des Kulturkolbens/der Kulturflasche(n), um die verbleibenden adhärenten Zellen freizugeben.
HINWEIS: Falls erforderlich und zur Beschleunigung des Trypsinisierungsprozesses, stellen Sie den Kolben bzw. die Kolben in einen 37 °C-Inkubator um. Gelöste Zellen nehmen unter einem Lichtmikroskop schnell eine abgerundete Form an. Dieser Schritt sollte ca. 5 Minuten dauern.
- 5 ml DMEM-Medium zugeben und die Klumpen dissoziieren, um eine einzellige Suspension herzustellen, indem der Inhalt jedes Kolbens auf und ab pipettiert wird.
- Die Zellsuspension wird durch ein Zellsieb mit 70 μm Poren in ein Röhrchen überführt.
- Schleudern Sie die Tube bei 400 x g für 5 min bei 4 °C herunter.
- Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie pelletierte Zellen in 10 ml sterilem, kaltem PBS.
- Wiederholen Sie die Schritte 1.6 und 1.7 zweimal.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer. Bereiten Sie eine einheitliche Suspension vor, die 4 x 107 Zellen/ml steriles PBS enthält.
- Injizieren Sie 500 μl der oben genannten Suspension intraperitoneal (i.p.) in jede erwachsene (6-12 Wochen alte) männliche oder weibliche C57BL/6-Maus.
>2. Behandlungsschemata
- Behandlungsschema zur Untersuchung des Beitrags von nTreg-Zellen zurT-CD8-Immundominanz
- Vier Tage vor dem In-vivo-Priming von C57BL/6-Mäusen mit C57SV-Zellen (Schritt 1.10) injizieren Sie jedem Tier einmal i.p. 0,5 mg eines Azid-freien monoklonalen Anti-CD25-Antikörpers (mAb) mit niedrigem Endotoxin (Klon PC-61.5.3), der nTreg-Zellen abbaut, oder mit einer IgG1-Isotypkontrolle der Ratte (z. B. Klon KLH/G1-2-2, Klon HRPN oder Klon TNP6A7).
- Behandlungsschema zum Testen der in vivo Bedeutung von programmierten Zelltodproteinen (PD-1-PD-L1(2)) Wechselwirkungen bei der Gestaltung derT-CD8-Immundominanz
HINWEIS: Die Bindung von PD-1 an PD-L1 vermittelt oft, aber nicht immer, die Co-Hemmung und/oder Erschöpfung von Ag-spezifischem TCD8. Daher kann die Behandlung mit Anti-PD-1 parallel zur Verabreichung von Anti-PD-L1- und Anti-PD-L2-mAbs durchgeführt werden, um die genaue interzelluläre Interaktion aufzudecken, die an einem biologischen Phänomen beteiligt ist.
>3. Präparation von Ziel-Splenozyten
- Euthanasieren Sie geschlechtsangepasste naive C57BL/6-Mäuse (im Alter von 6-12 Wochen), die durch Zervixluxation als Splenozytenspender dienen.
- Positionieren Sie jede Maus mit dem Bauch nach oben in einer biologischen Sicherheitswerkbank. Besprühen Sie die Haut mit 70% (v/v) Ethanol, EtOH. Heben Sie die Haut mit einer sterilen Pinzette und einer Schere an und machen Sie einen kleinen Schnitt in der ventralen Mittellinie. Schneiden Sie dann die Haut kreuzförmig ein, um das Bauchfell freizulegen.
- Ziehen Sie das Bauchfell mit einer Pinzette zeltartig nach oben, ohne eines der inneren Organe zu zerreißen. Schneiden Sie das Bauchfell auf, um die Bauchhöhle freizulegen, und entfernen Sie vorsichtig die Milz.
- Legen Sie die Milz(en) in einen 15 mL Dounce Tissue-Grinder, der 5 mL steriles PBS enthält. Üben Sie mit dem Glaskolben der Mühle manuellen Druck aus, bis sich das Milzgewebe in eine rote homogene Zellsuspension auflöst.
HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Empfängertiere pro Versuchsgruppe können mehrere Milz von Spendermäusen für die Vorbereitung der Zielzellen benötigt werden. Bis zu 3 Milzen können zusammen in einem 15-ml-Mahlwerk homogenisiert werden.
- Übertragen Sie das Homogenat in ein 15-ml-Röhrchen. Schleudern Sie die Tube bei 400 x g für 5 min bei 4 °C herunter.
- Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie pelletierte Zellen 4 Minuten lang in 4 ml Ammoniumchlorid-Kalium (ACK)-Lysingpuffer, um Erythrozyten zu eliminieren.
HINWEIS: Dies ist ein zeitkritischer Schritt. Eine übermäßige Exposition der Milzzellen gegenüber ACK-Lysingpuffer erhöht ihre Fragilität und macht sie anfällig für unspezifischen Zelltod.
- Geben Sie zu jedem Röhrchen 8 ml Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) Medium, das 10 % hitzeinaktiviertes FBS, L-Alanyl-L-Glutamin, 0,1 mM Minimum essentielle Medien (MEM) nichtessentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (HEPES) und 1x Penicillin/Streptomycin enthält, das im Folgenden als vollständiges RPMI-Medium bezeichnet wird (Table of Materials).
- Übertragen Sie den Inhalt durch 70 μm Poren eines Zellsiebs in ein neues 15 mL Röhrchen.
- Schleudern Sie die Tube bei 400 x g für 5 min bei 4 °C herunter.
- Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren Sie pelletierte Zellen in 12 ml vollständigem RPMI.
- Teilen Sie die Splenozytensuspension in 3 gleiche Portionen (je 4 ml) in 3 separate Röhrchen auf.
>4. Beschichtung von Ziel-Splenozyten mit irrelevanten und verwandten Peptiden
- Markieren Sie die Röhrchen entsprechend den Peptiden, die zum Pulsieren der Zielsplenozyten verwendet werden. Kontroll-Splenozyten werden mit einem irrelevanten Peptid gepulst, und jede Population verwandter Ziel-Splenozyten wird mit einem synthetischen Peptid gepulst, das dem von T Ag abgeleiteten immundominanten Epitop (Stelle IV) oder einem subdominanten T-Ag-Epitop (Stelle I oder Stelle II/III) entspricht (Tabelle 1).
HINWEIS: Die Wahl der irrelevanten Peptide hängt vom Versuchsaufbau und dem Mausstamm ab, der in der jeweiligen Untersuchung verwendet wird. Die Autoren verwenden häufig gB498-505 (ein H-2Kb-restriktives immundominantes Peptidepitop des Herpes-simplex-Virus [HSV]-1) und/oder GP33-41 (ein H-2Db-restriktives immundominantes Peptidepitop des lymphozytären Choriomeningitis-Virus ([LCMV]) in C57BL/6-Mäusen (Tabelle 1). Diese Peptide sind eine optimale Wahl, weil: (i) sie von Krankheitserregern abgeleitet sind, die zuvor in dem hier beschriebenen Mausmodell nicht vorgekommen sind; (ii) ähnlich wie T-Ag-abgeleitete Peptide sind gB498-505 und GP33-41 durch H-2-b-Moleküle beschränkt und binden an diese. In "Three-Peak"-In-vivo-Tötungsassays kann jeder der beiden Peaks, die verwandten Zielzellen entsprechen, Splenozyten darstellen, die mit einem immundominanten oder subdominanten Peptid gepulst wurden. Die Auswahl der einzelnen Peptidsätze variiert je nach den Zielen des jeweiligen Experiments. Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2 als Beispiele für eine solche Variation. Für den Rest dieses Protokolls werden die von T Ag abgeleiteten Stellen I und IV subdominante bzw. immundominante Peptide darstellen.
- Pulsieren Sie den Inhalt jedes markierten Röhrchens mit 1 μM des jeweiligen Peptids für 1 h bei 37 °C und 5 % CO2.
- Verwenden Sie für jedes Röhrchen ein separates Zellsieb (mit 70-μm-Poren), um bei Bedarf Klumpen und Ablagerungen zu entfernen.
- Das Röhrchen bei 400 x g 5 min bei 4 °C abdrehen. Den Überstand wegwerfen.
- Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 12 mL sterilem kaltem PBS und wiederholen Sie Schritt 4.4 noch einmal.
HINWEIS: Es ist wichtig, so viel FBS wie möglich zu entfernen, da FBS im nächsten Schritt Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE) binden kann.
>5. Markierung von Ziel-Splenozyten mit CFSE
- Resuspendieren Sie peptidgepulste Splenozyten in 4 ml sterilem PBS.
- CFSE in einer Dosis von 0,025 μM, 0,25 μM und 2 μM in die Röhrchen geben, die irrelevante Peptid-, Site-I- bzw. Site-IV-gepulste Splenozyten enthalten.
HINWEIS: Um eine gleichmäßige CFSE-Markierung zu erreichen, halten Sie jedes Röhrchen in einem Winkel von 45°, bevor Sie CFSE an der Seite etwas oberhalb der Zellsuspension hinzufügen, gefolgt von sofortigem sanftem Vortexen. Dadurch wird sichergestellt, dass am Ende glatte Histogramme angezeigt werden. Batch-to-Batch- und altersabhängige Schwankungen der CFSE-Intensitäten sind keine Seltenheit. Daher kann es notwendig sein, mit unterschiedlichen CFSE-Dosen zu experimentieren, bevor man sich für die optimalen Konzentrationen entscheidet.
Vorsicht: CFSE ist bei Konzentrationen von mehr als 5 μM toxisch.
- Legen Sie die Röhrchen für 15 min in einen 37 °C heißen Inkubator und drehen Sie sie alle 5 min um.
- Geben Sie 3 ml hitzeinaktiviertes FBS in jedes Röhrchen, um die CFSE-Reaktion zu stoppen. Füllen Sie den Inhalt mit sterilem PBS auf.
- Das Röhrchen bei 400 x g 5 min bei 4 °C abdrehen. Den Überstand wegwerfen.
- Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 12 ml sterilem PBS und wiederholen Sie Schritt 5.5.
>6. Untersuchung der adäquaten/gleichen CFSE-Markierung von Ziel-Splenozytenpopulationen
- Resuspendieren Sie pelletierte Zellen in 3 mL PBS.
- Wirbeln Sie die Schläuche sanft ein. Übertragen Sie jeweils 10 μl CFSE-Suspensionen, CFSE-Zwischensuspensionen (int) und CFSE-High-Zellsuspensionen in ein 5-ml-Polystyrol-Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortierungsröhrchen (FACS) mit rundem Boden, das 200 μL PBS ENTHÄLT.
- Untersuchen Sie Zellen mit einem Durchflusszytometer, das mit einem 488-nm-Laser ausgestattet ist. Zeichnen Sie ein Lymphozytentor basierend auf den Vorwärtsstreu- (FSC) und Seitenstreueigenschaften (SSC) der Zellen, bevor Sie 5000 Ereignisse erfassen, die innerhalb des Lymphozytengatters im FL-1-Kanal liegen.
- Zeichnen Sie innerhalb der "übergeordneten" CFSE+-Population zusätzliche Histogramm-Gates, um CFSE-niedrige, CFSE-int- und CFSE-hohe Subpopulationen zu identifizieren.
- Bestätigen Sie gleiche oder nahezu gleiche Ereignisnummern innerhalb der drei Gatter. Falls erforderlich, passen Sie die Zellzahl in den "Quell"-Röhrchen an (Schritt 6.1), bevor Sie die Ziel-Splenozyten mischen und in naive und geprimte Mäuse injizieren (Abschnitt 7).
>7. Injektion von CFSE-markierten Zielzellen in naive und T-Ag-geprimte Empfänger
- Wirbeln Sie die Quellrohre vorsichtig durch. Übertragen Sie die drei CFSE-markierten Zellsuspensionen in gleichen Verhältnissen in ein neues Röhrchen.
- Füllen Sie den Inhalt mit sterilem PBS auf.
- Schleudern Sie das Röhrchen bei 400 x g für 5 min bei 4 °C herunter. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen mit sterilem PBS.
- Zählen Sie Zellen in Trypanblau mit einem Hämozytometer, um eine zelluläre Lebensfähigkeit von mindestens 95 % zu gewährleisten.
- Passen Sie das Volumen an, um 1 x 107 gemischte Zielzellen/200 μl PBS intravenös (i.v.) über die Schwanzvene in jede Empfängermaus C57BL/6 zu injizieren.
HINWEIS: Lagern Sie die Zellen zwischen den Injektionen auf Eis. Mischen Sie die Zielzellen vor jeder Injektion vorsichtig. Notieren Sie für jede Maus den genauen Zeitpunkt der Injektion, der bestimmt, wann das Tier eingeschläfert werden muss. Es ist wichtig, die Dauer der In-vivo-Zytotoxizität bei allen Tieren im selben Versuch konsistent zu halten.
>8. Datenerfassung
- Zwei bis vier Stunden nach der Injektion von CFSE-markierten Zielzellen werden die Empfängermäuse durch Zervixdislokation eingeschläfert.
HINWEIS: Die Dauer der In-vivo-Zytotoxizität kann unter anderem in Abhängigkeit vom verwendeten Versuchssystem, der Immunogenität der Ziel-Ags, der erwarteten Häufigkeit von Peptidantigen-spezifischem TCD8 in der Milz und der Robustheit ihrer lytischen Funktion variieren.
- Jede Milz separat entfernen und bearbeiten, wie in den Schritten 3.2-3.9.
- Den Überstand verwerfen und die pelletierten Zellen in 3 ml PBS resuspendieren.
HINWEIS: Achten Sie vor der zytofluorimetrischen Analyse besonders darauf, das Milzgewebe und die Zellpräparate bei 4 °C oder auf Eis zu handhaben. Dadurch soll eine anhaltende Zytotoxizität ex vivo verhindert werden.
- Übertragen Sie ca. 1x107 Zellen aus jeder aufbereiteten Milz in ein sauberes FACS-Röhrchen.
- Verhören Sie Zellen sofort mit einem Durchflusszytometer, das mit einem 488-nm-Laser ausgestattet ist. Zeichnen Sie ein Lymphozyten-Gate basierend auf den FSC- und SSC-Eigenschaften der Zellen.
- Identifizierung der Splenozyten des CFSE-Empfängers und der CFSE+-übertragenen Zielzellen. Zeichnen Sie zusätzliche Gates, die unterschiedliche CFSE-Zielzellpopulationenmit niedrigem, CFSE-int undhohem CFSE-Ziel aufnehmen.
- Erfassen Sie insgesamt 2000CFSE-Tiefereignisse im FL-1-Kanal.
>9. Datenanalyse
- Berechnen Sie die spezifische Lyse jeder verwandten Zielzellpopulation mit der folgenden Formel:
% Spezifische Zytotoxizität = 
wobei x = CFSEint/hohe Ereigniszahl in einer T-Ag-geprimten Maus, y =niedrige CFSE-Ereignisnummer in einer T-Ag-geprimten Maus, a = CFSEint/hohe Ereigniszahl in einer naiven Maus und b =CFSE-niedrige Ereigniszahl in einer naiven Maus.
Anmerkung: Bei "Drei-Peak"-Zytotoxizitätsassays, bei denen die spezifische Lyse von mehr als einer verwandten Zielpopulation ausgewertet wird, ist es nicht angebracht, Zielzellfrequenzen zu verwenden. Dies liegt einfach daran, dass die Häufigkeit einer verwandten Zielzellpopulation nicht nur durch den Prozentsatz der irrelevanten Kontrollen, sondern auch durch den der anderen verwandten Zielsplenozyten beeinflusst wird. Daher sollten Ereignisnummern innerhalb jedes Gatters in der obigen Formel verwendet werden, um die Lyse jeder verwandten Zielzellpopulation (entweder CFSE-int- oder CFSE-Hochzellen) im Vergleich zu CFSE-Tiefkontrollen genau zu berechnen.
Tabelle 1. Peptide, die in diesem Protokoll eingeführt werden.
| Protein-Antigen-Quelle | Peptid-Epitop | Bezeichnung | Reihenfolge | MHC I-Einschränkung |
| SV401 Großes T Ag2 | T AG206-215 | Standort I | SAINNYAQKL | H-2Db |
| SV40 Großes T Ag | T Ag223-231 | Standort II/III | CKGVNKEYL | H-2Db |
| SV40 Großes T Ag | T Ag404-411 | Standort IV | VVYDFLKC | H-2Kb |
| SV40 Großes T Ag | T Ag489-497 | Standort V | QGINNLDNL | H-2Db |
| HSV-13 Glykoprotein B | gB498-505* | gB498-505 | SSIEFARL | H-2Kb |
| LCMV4 Glykoprotein | GP33-41* | GP33-41 | KAVYNFATC | H-2Db |
| 1Affenvirus 40 | | | | |
| 2Antigen großer Tumore | | | | |
| 3Herpes-Simplex-Virus Typ 1 | | | |
| 4Lymphozytäres Choriomeningitis-Virus | | | |
| *als irrelevantes Peptid verwendet | | | |
