TIRF-Mikroskopie-basierte Visualisierung der Phagosomenbildung und des Phagosomenverschlusses

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

Hinweis: Das verwendete Plasmid Lifeact-mCherry ist ein freundliches Geschenk von Dr. Guillaume Montagnac, Institut Curie, Paris.

>1. Zellen und Transfektion

Hinweis: RAW264.7 Makrophagen werden in einem 100 mm Medium (RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 Medium, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin und 10% FCS (Fetal Calf Serum)) zu Subkonfluenz gezüchtet. Sie werden mit Plasmiden transfiziert, die für fluoreszenzmarkierte Proteine durch Elektroporation kodieren. Routinemäßig werden ca. 5 - 6 x 10⁶ Zellen mit 20 μg bzw. 10 μg Plasmid für jede Transfektion bzw. Co-Transfektion transfiziert. Beachten Sie, dass andere Transfektionsmethoden, die auf Elektroporation oder Lipofektion basieren, als alternative Ansätze verwendet werden können.

1. Kratzen Sie die Zellen mit einem Zellheber ab und resuspendieren Sie sie in 10 ml Kulturmedium, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren.
2. Zentrifugieren Sie die Küvettensuspension 300 x g, 5 min bei RT im Schwingwinkelrotor.
3. 10 ml vollständiges Medium, zugegeben mit 10 μg/ml Gentamicin, auf 37 °C vorheizen.
4. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und das Pellet in 3 ml "Waschpuffer A" aus dem Elektroporationskit resuspendiert.
5. Die Küvettensuspension 300 x g, 5 min bei Raumtemperatur im Schwingwinkelrotor zentrifugieren.
6. In der Zwischenzeit wird der DNA-Mix bei Raumtemperatur hergestellt: 120 μl 2x Puffer B, 20 μg Plasmid-DNA, die für das gewünschte Protein kodiert, q.s.p. 240 μl H₂O.
7. Nach der Zentrifugation ist der gesamte Überstand zu verwerfen.
8. Das Zellpellet in der DNA-Mischung resuspendieren und in 4 mm Elektroporationsküvetten überführen.
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9. Minuten bei RT inkubieren.
10. Elektroporat bei 250 V, 900 μF.
11. Die Zellen werden sofort in das vorgewärmte (37 °C) vollständige Medium, das mit Gentamicin versetzt ist, resuspendiert und in einer 100-mm-Schale anrichten.
12. Die transfizierten Zellen werden über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert.
13. Ersetzen Sie am nächsten Morgen das komplette Medium durch 10 ml serumfreies Mikroskopiemedium (RPMI 1640 ohne Phenolrot, 10 mM HEPES, 1 mM Natriumpyruvat, 50 μM β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin).

>2. Opsonisierung der roten Blutkörperchen

Hinweis: Als Modell für ein Teilchenziel für Makrophagen werden rote Blutkörperchen (SRBCs) von Schafen verwendet. In der Regel werden ca. 7 x 10⁶ SRBCs pro 35 mm Glasbodenschale verwendet.

1. Waschen Sie die SRBCs mit 100 μl 1x PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)/0,1% BSA (Rinderserumalbumin) und zentrifugieren Sie sie (600 x g, 4 min).
2. Nach der Zentrifugation wird der Überstand verworfen und die SRBC in 100 μl 1x PBS/0,1 % BSA resuspendiert und zentrifugiert (600 x g, 4 min).
3. Nach der Zentrifugation ist der Überstand zu verwerfen und die SRBC in 1x PBS/0,1 % BSA mit Kaninchen-IgG-Anti-SRBCs in subagglutinierender Konzentration zu resuspendieren. Verwenden Sie 500 μl Lösung mit Antikörpern/5 μl SRBCs.
   Anmerkung: Die subagglutinierende Konzentration von Antikörpern entspricht der niedrigsten Konzentration, die keine Agglutination induzierte, die als Bildung eines Netzwerks nachgewiesen wurde. Im Allgemeinen beträgt die subagglutinierende Konzentration 8,2 μg/ml.
   1. Bestimmen Sie die Konzentration von IgG-Anti-SRBCs, die zur Opsonisierung der SRBCs erforderlich ist, durch einen Hämagglutinationstest. Verdünnen Sie die IgG-Anti-SRBCs (Stamm bei 13,1 mg/ml) seriell zwischen 1/50 und 1/25.600 in einer Mikrotiterplatte. Geben Sie 2 x 10⁶ SRBCs in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei RT für mehrere Stunden.
4. 30 Minuten lang bei RT mit langsamer Rotation inkubieren.
5. Nach zwei Wäschen in 1x PBS/0,1% BSA wie oben beschrieben, resuspendieren Sie die IgG-opsonisierten SRBCs (IgG-SRBCs) in vorgewärmtem serumfreiem Mikroskopiemedium (2 ml/Schale).

>3. Poly-Lysin-Beschichtung von Deckgläsern

1. In der Zwischenzeit 35 mm Glasbodenschalen mit 2 ml 0,01 % Poly-L-Lysin 30 min bei Raumtemperatur behandeln.
2. Spülen Sie das Geschirr zweimal mit 2 ml 1x PBS.

>4. Nicht-kovalente Fixierung von SRBCs auf Glasbodenschalen

1. Gießen Sie 2 ml SRBCs-Suspension in eine 35 mm Glasbodenschale.
2. Mit einem schwingenden Rotor bei 500 x g während 2 min auf 35 mm Glasbodenschalen zentrifugieren.
3. Den Überstand entfernen und einmal mit 2 ml 1x PBS/10% BSA waschen.
4. Inkubieren Sie die Partikel 30 Minuten lang mit 2 ml 1x PBS/10% BSA pro Schale.
5. Spülen Sie das Geschirr dreimal mit 2 ml 1x PBS.
6. Ersetzen Sie 1x PBS durch 2 ml vorgewärmtes (37 °C) serumfreies Mikroskopiemedium.

>5. Phagozytose visualisiert durch TIRFM

1. Mikroskop
   Anmerkung: Die TIRFM wurde mit einem Mikroskop durchgeführt, das mit einem Ölimmersionsobjektiv (N 100X, NA1.49), einer Heizkammer mit CO₂ und zwei Einzelphotonen-Detektionskameras EMCCD (Electron Multiplying Charge Coupled Device) in Verbindung mit einer 1,5-fachen Linse ausgestattet war.
   1. Schalten Sie am Tag vor der TIRF-Mikroskopsitzung die Heizkammer bei 37 ºC ein, um eine homogene Erwärmung des Mikroskoptisches zu ermöglichen.
2. Bestimmung des kritischen Winkels
   Anmerkung: Die ImageJ Color Profiler-Software wird zur Verarbeitung von TIRF-Bildströmen verwendet.
   1. Legen Sie eine 35-mm-Glasbodenschale mit opsonisiertem SRBC und serumfreiem Mikroskopiemedium unter das Mikroskop.
   2. Kratzen Sie die Zellen ab und resuspendieren Sie sie im Medium, bevor Sie sie (100 - 500 μl) in die Schale geben.
   3. Verwenden Sie die "Live Acquisition"-Software, um das Mikroskop zu steuern und eine Anregung mit einem 491-nm- und/oder einem 561-nm-Laser durchzuführen, um Zellen zu identifizieren, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren.
   4. Identifizieren Sie eine Zelle, die die fluoreszenzmarkierten Proteine exprimiert.
   5. Platzieren Sie es in der Mitte des Bildfeldes und nehmen Sie 500 Bilder mit einer Anregungswellenlänge auf, mit verschiedenen Winkeln von 0º bis 5º, in Schritten von 0,01º (Abbildung 1A). Die Winkel werden durch das Mikroskopsystem automatisch verändert.
   6. Bestimmen Sie den kritischen Winkel, der es ermöglicht, dass das einfallende Licht an der Grenzfläche zwischen Glas und Medium vollständig reflektiert wird, und erzeugen Sie die evaneszente Welle. Öffnen Sie mit der ImageJ Color Profiler-Software die Bildsequenz, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" klicken und die Datei auswählen.
   7. Wählen Sie mit dem rechteckigen Werkzeug einen Bereich of Interest (ROI) in der Zelle mit einer gleichmäßigen Fluoreszenz aus (Abbildung 1B gelb 1).
   8. Plotten Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des "Z-Achsen-Profils", gemessen in der ROI, mit Funktion der Winkel auf der x-Achse, indem Sie auf die Registerkarte "Bild", "Stapel" im Dropdown-Menü und "Z-Achsen-Profil plotten" klicken (Abbildung 1B rot 2).
      Hinweis: Der kritische Winkel ist der Winkel, der zur maximalen Fluoreszenz führt, bevor die Fluoreszenz stark abnimmt.
   9. Verwenden Sie einen beliebigen Wert des Winkels auf der x-Achse, der während der Mikroskopiesitzung größer ist als der kritische Winkel, um ein TIRF-Signal zu erhalten, z. B. 2,00 (Abbildung 1C).
3. erwerbungen
   1. Richten Sie mit der Live Acquisition-Software die Parameter für die Erfassung mit dem Modul "Protocol Editor" ein (Abbildung 2A).
      1. Erstellen Sie ein Protokoll mit einer "Schleife", die eine "Mehrkanal"-Erfassung umfasst, um das Fluoreszenzsignal von Proteinen von Interesse in der TIRF-Region zu erfassen. Geben Sie den TIRF-Winkel (z. B. 2,00), die Belichtungszeit (z. B. 50 ms) und die Laserintensität (z. B. 50 %) ein (Abbildung 2B 1).
      2. Führen Sie eine "Z-Bewegung" des Objektivs 3 μm über dem TIRF-Bereich ein, um eine Signalerfassung in Epifluoreszenz mit dem "Multi Channels"-Tool zu erhalten. Geben Sie einen Winkel unterhalb des kritischen Winkels (z. B. 1,00), der Belichtungszeit (50 ms) und der Laserintensität (50 %) ein (Abbildung 2B, 2 und 3).
      3. Als nächstes fügen Sie eine "z-Verschiebung" des Ziels 3 μm darunter hinzu, um in den TIRF-Bereich zurückzukehren (Abbildung 3B 4). Fügen Sie einen "Schnappschuss" der Zelle in heller Licht-LED (Leuchtdiode) hinzu (Abbildung 2B 5).
   2. Finden Sie eine Zelle von Interesse mit einer moderaten Expression fluoreszenzmarkierter Proteine, die die Phagozytose von SRBC einleitet, indem sie die Plasmamembran um das Partikel herum ausdehnt.
   3. Platzieren Sie es in der Mitte des Feldes.
   4. Starten Sie die Streaming-Erfassung von 500 bis 1.000 Frames. Geben Sie auf der Registerkarte "Schleifenanzahl" "750 Frames" ein (Abbildung 2B 1).
      Anmerkung: Die ImageJ Color Profiler-Software wird zur Verarbeitung von TIRF-Bildströmen verwendet.
   5. Öffnen Sie die Sequenzbilder in der Image J-Software, indem Sie auf "Datei", "Öffnen" klicken und die Datei auswählen.
   6. Trennen Sie die Kanäle, indem Sie auf den Reiter "Bild", "Hyperstacks" und auf die Funktion "Stack to Hyperstack" klicken. Füllen Sie das angezeigte Fenster aus: Reihenfolge: xyctz; Kanal (c): Anzahl der Kanäle (z. B. "2", wenn Sie zwei Fluorochrome haben); Slices (z): Anzahl der Slices in der z-Achse (z. B. "1", wenn sich die z-Achse nicht bewegt); Frames (t): Anzahl der Bilder geteilt durch die Anzahl der Kanäle; Anzeigemodus: Graustufen.
      Anmerkung: Es werden zwei separate Bildsequenzen erzeugt, die den beiden verschiedenen Kanälen entsprechen.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des mittels TIRFM analysierten "Phagosome Closure Assay". Der Phagosomenverschluss-Assay wird mit Makrophagen durchgeführt, die vorübergehend ein oder zwei fluoreszenzmarkierte Proteine exprimieren. Makrophagen werden auf IgG-opsonisierten SRBCs abgelagert, die nicht kovalent auf Polylysin-beschichteten Deckgläsern fixiert sind. Die Bilder werden im TIRF-Modus aufgenommen, um die Stelle des Phagosomenverschlusses zu detektieren, und im Epifluoreszenzmodus, um die Basis des phagozytären Bechers zu detektieren.

Abbildung 2: Bestimmung des kritischen Winkels für TIRFM. (A) Bei der "Lebenderfassung" wird eine Zelle, die fluoreszenzmarkierte Proteine exprimiert, in der Mitte des Feldes platziert (Region 1 in rot). Mit der TIRF-Stack-Option wurden Bilder bei einer Anregungswellenlänge mit unterschiedlichen Winkeln von 0° bis 5° mit einem Schritt von 0,01° aufgenommen (Bereich 2 in rot). (B) Die Bildsequenz wird mit der ImageJ Color Profiler-Software geöffnet und die mittlere Fluoreszenzintensität eines interessierenden Bereichs (ROI) wird in Abhängigkeit von den Winkeln auf der x-Achse unter Verwendung von "Stacks" und "PlotZ-Achsenprofil" (Bereich 1 in rot) dargestellt. (C) Die x-Position des Fluoreszenzpeaks auf dem Diagramm entspricht dem kritischen Winkel: 1,98° (schwarze gestrichelte Linie). Jeder Wert nach diesem Winkel kann verwendet werden. Als Beispiel kann 2,00° gewählt werden (rote Linie).

Abbildung 3. Workflow-Prozess mit dem Live-Erfassungsmodul: "Protokolleditor". (A) Im Fenster "Protokolleditor" wird ein Workflow-Canvas erstellt. (B) Dieses Protokoll besteht aus einer "Schleife" von Aktionen, die das Mikroskop so oft wiederholt, wie es der Benutzer bestimmt. Als Beispiel: 750 (1). Eine Schleife beinhaltete: "Mehrkanal"-Erfassung mit Laseranregung von fluoreszierenden Proteinen von Interesse im TIRF-Modus. Beispiel: Laser 491 nm Intensität 50% -TIRF-Winkel 2,00 (2); "Z-Bewegung" des Ziels 3 μm (3); "Mehrkanal"-Erfassung im Epifluoreszenzmodus (4); "Z-Move" des Objektivs zurück in den TIRF-Bereich (5) und ein "Snapshot" im Durchlicht (6).