Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Isolierung durch Dichtegradient von humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)
- Geben Sie 25 ml heparinisiertes Vollblut mit einer 25 ml Pipette in ein 50 ml Röhrchen.
- Verdünnen Sie die Zellen mit 25 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Geben Sie 15 ml Ficoll-Paque-Dichtegradient in ein neues 50-ml-Röhrchen und fügen Sie bei Kippen des Röhrchens sehr langsam und vorsichtig 25 ml der verdünnten Zellsuspension über dem Dichtegradienten hinzu, so dass es zu keiner Vermischung des Vollblutes mit dem Dichtegradienten kommt, d. h. zu keiner Störung der Grenzfläche zwischen Blut- und Dichtegradienten.
- Die Suspension aus Stufe 1.2 bei 400 × g für 30 bis 40 min in einem temperierten Ausschwingrotor ohne Bremse bei 20 °C zentrifugieren.
Anmerkung: Nach der Zentrifugation sollten drei unterschiedliche Schichten erkennbar sein: die obere Schicht ist Plasma; die untere klare Schicht ist der Ficoll-Paque-Dichtegradient; und eine dünne, mittlere Zellschicht, die die PBMCs sind.
- Aspirieren und verwerfen Sie die obere Schicht durch Absaugen mit einer Pasteurpipette, wobei darauf zu achten ist, dass die Interphasenschicht der mononukleären Zellen (d. h. Lymphozyten, Monozyten und Blutplättchen) nicht gestört wird.
- Entnehmen Sie diese mononukleäre Zellschicht vorsichtig mit einer 10-ml-Pipette in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
- Füllen Sie das Röhrchen mit 20 ml PBS, mischen Sie es gut und zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 10 min bei 20 °C. Entfernen Sie den Überstand nach der Zentrifugation vollständig.
- Das Küvettenpellet in 20 ml PBS resuspendieren und bei 200 × g für 10-15 min bei 20 °C zentrifugieren. Den Überstand nach der Zentrifugation vollständig entfernen.
Anmerkung: Dieser Schritt entfernt die Blutplättchen, die in den PBMCs unerwünscht sind; Dieser Schritt kann wiederholt werden, um eine vollständige Entfernung der Blutplättchen zu gewährleisten.
- Wenn keine Auswahl spezifischer Populationen gewünscht ist, resuspendieren Sie das Zellpellet in Leukozyten-Vollmedium (10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % L-Glutamin und 1 % Penicillin/Streptomycin in RPMI-1640-Medium) zur Kultivierung, nachdem Sie eine Zellzählung durchgeführt haben, um 1 ml Medium pro 107 PBMCs zu suspendieren, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
2. Magnetische Markierung von Leukozytenpopulationen
- Die PBMC-Suspension bei 300 × g 10 min zentrifugieren und den Überstand vollständig absaugen.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in 80 μl PBS pro 107 Zellen insgesamt.
- Fügen Sie 20 μl spezifizierter magnetischer Kügelchen (d. h. CD14-Magnetkügelchen zur Isolierung von Monozyten, CD4-Magnetkügelchen zur Isolierung von T-Lymphozyten) pro 107 Gesamtzellen hinzu.
- Gut mischen und 15 min bei 2 bis 8 °C im Kühlschrank inkubieren.
- 1-2 ml PBS pro 107 Zellen zum Waschen hinzufügen und 10 Minuten lang bei 300 × g zentrifugieren.
- Der Überstand wird vollständig aspiriert und bis zu 108 Zellen in 500 μl PBS resuspendiert.
>3. Magnetische Selektion von Leukozyten-Subpopulationen
Hinweis: Eine Vielzahl von magnetischen Bead-Separatoren und -Säulen sind für die Isolierung einer bestimmten Population von Leukozyten durch Zelloberflächenmarker von einer Reihe von Herstellern verfügbar. Die Isolierung kann durch positive Selektion auf der Grundlage eines oder weniger positiver Marker oder durch negative Selektion nach Erschöpfung unerwünschter Populationen erfolgen. Im Folgenden wird ein allgemeiner Ansatz zur Durchführung einer positiven Selektion unter Verwendung eines Markers (d. h. CD4 für T-Helfer-Lymphozyten oder CD14 für Monozyten) skizziert.
- Magnetabscheider inkl. Trennsäule nach Herstellerangaben vorbereiten und ansaugen.
- Das Röhrchen mit der Probe der markierten PBMCs aufsetzen. Zwei 15-ml-Zentrifugenröhrchen zur Entnahme der positiv markierten und unmarkierten Zellfraktionen gemäß den Anweisungen des Herstellers bereitstellen.
- Zählen Sie die Zellzahl und resuspendieren Sie die positiv selektierten Leukozyten (d. h. CD4+ T-Lymphozyten oder CD14+ Zellen) in Leukozyten-Vollmedium unter Verwendung von 1 ml Medium pro 107 Zellen.
>4. Carboxyfluorescein-Succinimidylester (CFSE)-Färbung von Leukozyten zur Beurteilung der Proliferation
Hinweis: CFSE wurde häufig in immunologischen Untersuchungen eingesetzt, sowohl für in vivo als auch in vitro Studien. Unser Protokoll wurde für die In-vitro-Studie von MSC/PBMC-Wechselwirkungen (oder anderen Leukozyten) optimiert. Während die allgemeinen Schritte bei der Durchführung der CFSE-In-vitro-Markierung ähnlich sind, kann es Unterschiede in der spezifischen Dosis und dem Zeitplan des Protokolls geben. Dies kann auf eine Reihe von Faktoren zurückzuführen sein, z. B. auf den verwendeten spezifischen Zelltyp, die verwendete Zellzahl - was wahrscheinlich die Intensität des CFSE-Fluoreszenzsignals beeinflussen kann.
- Die CFSE-Stammlösung (10 mM) in PBS auf die gewünschte Arbeitskonzentration von 10 μM (CFSE-Arbeitslösung) verdünnen. Bereiten Sie 107 Zellen (d. h. PBMCs oder T-Zellen) für die Markierung mit der CFSE-Arbeitslösung vor.
- Bei 300 × g für 10 min zentrifugieren, um ein Zellpellet zu erhalten und den Überstand abzugasen.
- Die Zellen werden vorsichtig in 1 ml vorgewärmter (37 °C) CFSE-Arbeitslösung resuspendiert und 10 min bei 37 °C inkubiert.
- Um überschüssiges CFSE abzuwaschen, verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem 10-fachen (Vol.) vorgekühltem (4 °C) RPMI-Medium mit 10 % FBS. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 x g für 5 min sedimentiert und der Überstand wird verworfen. Waschen Sie das Zellpellet auf diese Weise noch zweimal.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation erneut und zählen Sie die Zellzahl. Resuspendieren Sie 107 Zellen (entweder PBMCs oder T-Zellen) in 1 ml frisch vorgewärmtem Leukozyten-Komplettmedium.
>5. Effektor-Suppressions-Assay Magnetic Bead-selektierte, MSC-induzierte immunmodulatorische Leukozyten auf aktivierten CFSE-markierten Effektor-CD4 + T-Zellen
- Säen Sie MSCs mit 250.000 Zellen in 3 ml MSC und vervollständigen Sie das Medium in 6-Well-Platten (MSC-Dichte: 25.000 Zellen/cm2) für die Anheftung O/N in einem 37 °C-Inkubator, so dass die Stammzellen eine Konfluenz von 80 % erreichen können. Mindestens 3 6-Well-Platten sind erforderlich, um sicherzustellen, dass genügend MSC-kokultivierte PBMCs für die Subpopulationsselektion vorhanden sind.
- Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie PBMCs hinzu, die gemäß Schritt 1 getrennt sind, jedoch in 6-Well-Platten mit 2,5 x 106 Zellen/Well (Zelldichte: 250.000 Leukozyten/cm2) mit 3 ml Leukozyten-Vollmedium. Co-Kultur für 48-72 Stunden in einem 37 °C Inkubator.
- Spezifische Population von MSC-induzierten immunmodulatorischen Leukozyten (d. h. CD14+-Zellen) durch magnetische Bead-Selektion gemäß den Abschnitten 2-3.
Anmerkung: An dieser Stelle kann eine intrazelluläre Zytokinfärbung für die durchflusszytometrische Analyse durchgeführt werden, um Veränderungen im Leukozytenzytokin-Expressionsprofil zu beurteilen, d. h. die Expression von Interleukin-10-as, das durch MSCs moduliert wird.
- Fügen Sie CFSE-markierte allogene CD4+-T-Zellen, die gemäß den Abschnitten 2-4 in 24-Well-Platten in 1 ml Leukozyten-Vollmedium (T-Zelldichte: 250.000 Zellen/cm2) erzeugt wurden, zu bead-selektierten MSC-induzierten Leukozyten in verschiedenen Verhältnissen hinzu, d. h. 1:10, 1:5, 1:2 und 1:1 (Zell-zu-Zelle) Verhältnissen.
- Um CD4+ T-Zellen zu stimulieren, fügen Sie α-CD3/28-konjugierte Mikrokügelchen hinzu, um ein Kügelchen-zu-Zell-Verhältnis von 1:1 zu erhalten.
- Für eine Negativkontrolle werden 500.000 CD4+ T-Zellen/Well in einer 24-Well-Platte (T-Zelldichte: 250.000 Zellen/cm2) nur mit 1 ml Leukozyten-Vollmedium disponiert; für die Positivkontrolle wird zusätzlich zur Beschichtung der gleichen Anzahl von CD4+ T-Zellen/Well α-CD3/28 konjugierte Mikrokügelchen hinzugefügt, um ein Bead-to-Cell-Verhältnis von 1:1 zu erhalten.
- Am 3. Tag der Co-Kultur ist die Proliferation von CFSE-markierten CD4+ T-Zellen (in Röhrchen mit rundem Boden) durch durchflusszytometrische Analyse mit 488 nm Anregungs- und Emissionsfiltern zu beurteilen, die für Fluorescein geeignet sind.