Eine in vitro Flow-Untersuchung der Wirkung von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten

Zusammenfassung

Quelle: Munir, H. et al., Analyse der Auswirkungen von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten aus dem Fluss. J. Vis. exp.(2015)

Das Video zeigt eine Methode zur Untersuchung des Einflusses von Stromazellen auf die Rekrutierung von Leukozyten. In einem Modell mit paralleler Plattenströmungskammer induzieren proinflammatorische Zytokine die Expression von Adhäsionsrezeptoren durch Endothelzellen, was die Rekrutierung und Migration von Neutrophilen erleichtert. Die Wechselwirkung zwischen Stromazellen und Endothelzellen verringert die Rekrutierung von Neutrophilen zu den Endothelzellen.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Isolierung und Kultivierung von primären menschlichen Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen

1. Isolierung und Kultivierung von humanen Nabelvenendothelzellen (HUVEC):
   1. Legen Sie die Nabelschnur auf ein Tablett mit Papiertüchern und besprühen Sie sie mit 70% Ethanol. In eine Gewebekulturhaube geben. Identifizieren Sie die Vene und kanülieren Sie an beiden Enden. Legen Sie einen Kabelbinder um das kanülierte Ende, um es zu sichern.
   2. Waschen Sie das venöse Blut mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit einer Spritze aus. Füllen Sie die Spritze mit Luft und führen Sie sie durch die Vene, um das restliche PBS zu entfernen und zu entsorgen.
   3. 10 mg/ml Kollagenase Typ Ia auftauen und 1:10 in PBS (mit Calcium- und Magnesiumchlorid) auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen. Kollagenaselösung in die Vene geben, bis beide Kanülen gefüllt sind. Schließen Sie die Klemmen an den Kanülen an beiden Enden.
   4. Decken Sie das Tablett mit einem Taschentuch ab und besprühen Sie es mit 70% Ethanol. Legen Sie das Kabel für 20 min bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO₂) in einen Inkubator.
   5. Nehmen Sie das Kabel aus dem Inkubator und ziehen Sie die Kabelbinder fest. Massieren Sie die Nabelschnur 1 Minute lang sanft. Die Zellsuspension mit 10 ml PBS ausspülen und in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen auffangen.
   6. Füllen Sie die Spritze mit Luft und führen Sie sie zweimal durch die Vene, um eventuelle PBS-Reste zu entfernen, und sammeln Sie das PBS in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das in Schritt 1.1.5 verwendet wurde. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
   7. Überstand aspirieren und Pellet in 1 ml vollständigem Endothelzellmedium (EC) resuspendieren. Das EC-Medium besteht aus M199, ergänzt mit 35 μg/ml Gentamicinsulfat, 10 ng/ml humanem epidermalem Wachstumsfaktor, 1 μg/ml Hydrocortison, 2,5 μg/ml Amphotericin B und 20 % fötalem Kälberserum.
   8. 4 ml EC-Medium und die EC-Suspension werden in einen 25-cm-2-Kolben gegeben. Wechseln Sie das Medium am nächsten Tag und dann alle 2 Tage.
   9. ECs weist eine kopfsteinpflasterartige Morphologie auf (Abbildung 1Ai). Bei Adhäsionsassays werden ECs in der Regel ausgeimpft, wenn sie eine Konfluenz von 100 % erreichen (siehe Abschnitt 1.4).
2. Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Wharton-Gelees (WJMSC) aus menschlichen Nabelschnüren:
   1. Isolieren Sie Wharton's aus Gelee gewonnenes MSC (WJMSC) aus frischen Nabelschnüren oder aus Schnüren, die bereits zur Isolierung von EC verwendet wurden. Schneiden Sie die Nabelschnur in 5 cm lange Stücke. Schneiden Sie jedes Stück in Längsrichtung ab, um die Blutgefäße freizulegen (2 Arterien [weiß, starr] und 1 Vene [gelb, aufgebläht]).
   2. Mit sterilen Scheren und Pinzetten die Blutgefäße entfernen und entsorgen. Schneiden Sie das gesamte Gewebe in 2 - 3 mm³ Stücke. Mit einer Pinzette 2 - 3 mm³ Stück in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen geben.
   3. 100 mg/ml Stammkollagenase Typ II auftauen und 1:100 in 10 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 mg/ml verdünnen. 20.000 U/ml Stammhyaluronidase auftauen und 1:400 auf eine Endkonzentration von 50 U/ml in der Kollagenaselösung verdünnen.
   4. Geben Sie einen enzymatischen Cocktail in das Zentrifugenröhrchen, das die Gewebefragmente enthält. Die Gewebefragmente werden 5 Stunden lang bei 37 °C auf einem langsamen Rotator inkubiert.
   5. Verdünnen Sie die Zellsuspension 1:5 in PBS. Setzen Sie einen 100 μm Porenfilter in ein neues 50-ml-Zentrifugenröhrchen ein. Gießen Sie die Zellsuspension auf den 100 μm Porenfilter.
      Anmerkung: Verbleibende Gewebefragmente werden auf dem Filter zurückgehalten und die Zellen werden im 50-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt.
   6. Entsorgen Sie den Filter. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 400 x g für 10 min bei RT. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das WJMSC-Pellet in 12 ml vollständigem WJMSC-Kulturmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM Low Glucose, 10% fetales Kälberserum (FCS) und 100 U/ml Penicillin + 100 μg/ml Streptomycin-Mix).
   7. Alle Zellen werden in einen 75 cm großen Kulturkolben mit² Geweben ausgesät. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden mit 12 ml vollständigem WJMSC-Kulturmedium. Ersetzen Sie das Medium alle 2 - 3 Tage. Die Zellen sollten innerhalb von 2 Wochen eine Konfluenz von 70 - 80% erreichen. Passage, wenn WJMSC eine Konfluenz von 70 - 80 % erreicht (siehe Abschnitt 1.4).
3. Expansion der aus dem Knochenmark gewonnenen MSC (BMMSC):
   1. Isolierung von MSC (BMMSC) aus menschlichem Knochenmark wie zuvor beschrieben. 10 ml vorgewärmte mesenchymale Stammzelle, MSC-Wachstumsmedium (MSCGM) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben.
   2. Tauen Sie ein Fläschchen mit p2 BMMSC auf, indem Sie es 2 Minuten lang in ein 37 °C heißes Wasserbad stellen. Geben Sie die BMMSC-Suspension in das Zentrifugenröhrchen, das MSCGM enthält. Durch Pipettieren gut mischen.
   3. Bei 400 x g 5 min bei RT zentrifugieren. Überstand vollständig ansaugen.
   4. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml MSCGM und zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem digitalen Zellzähler wie einem Cellometer.
   5. Samenzellen in 75 cm² Kulturkolben mit einer Dichte von 5.000 - 6.000 Zellen pro^cm2 in 12 ml MSCGM. Wechseln Sie das Medium nach 24 Stunden mit 12 ml MSCGM. Füttern Sie die Zellen alle 2 - 3 Tage mit 12 ml MSCGM.
   6. Passage, wenn BMMSC 70 - 80 % Konfluenz erreicht (siehe Abschnitt 1.4). Die Zellen weisen eine fibroblastische Morphologie auf (Abbildung 1Aii).
4. Ablösung von EC und MSC:
   1. Medium aus 25 cm 2 Kulturkolben aspirieren. 2 ml 0,02% Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) für ca. 2 min zugeben. EDTA aspirieren und 2 ml Trypsin (2,5 mg/ml) hinzufügen. Betrachten Sie unter dem Mikroskop, bis die Zellen rund werden.
   2. Tippen Sie auf den Kolben, um die Zellen zu lösen. Inaktivieren Sie das Trypsin durch Zugabe von 8 ml Kulturmedium (abhängig vom Zelltyp; EC-Medium für HUVEC, DMEM LG für WJMSC und MSCGM für BMMSC) in den Kulturkolben geben und die Suspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   Bei
   3. 400 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Überstand aspirieren und das Pellet wie unten beschrieben resuspendieren.
      1. Für die Passage von MSC resuspendieren Sie das Pellet in einem 3-ml-Nährmedium. 11 ml Nährmedium werden in drei separate 75 cm² Kulturflaschen gegeben. 1 ml Zellsuspension in jeden Kulturkolben geben (1:3-Teilung). Passage WJMSC und BMMSC 3 mal (p3) vor der Verwendung in Co-Kultur-Assays.
      2. Für die Aussaat von EC oder MSC in Adhäsionsassays – siehe Abschnitte 2 und 3.
5. Einfrieren von MSC:
   1. Am Durchgang 3 ist das MSC wie in Abschnitt 1.4 beschrieben zu lösen. Überstand aspirieren und in 3 ml eiskaltem CryoSFM resuspendieren. Pipettieren Sie 1 ml Aliquots der Zellsuspension in 1,5 ml eiskalte Kryoröhrchen. Legen Sie Kryoröhrchen in einen Gefrierbehälter.
   2. Den Behälter bei -80 °C O/N lagern. In flüssigen Stickstoff umfüllen. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit MSC auf (befolgen Sie die Schritte 1.3.1 - 1.3.6). MSC wird in einem 5-ml-Nährmedium resuspendiert (wählen Sie das geeignete Medium für WJMSC oder BMMSC) und in einen 25-cm-2-Kolben aussäen.

>2. Etablierung von endothelial-mesenchymalen Stammzell-Cokulturen auf Filtern

1. WJ oder BMMSC wie in Abschnitt 1.4 beschrieben ablösen. Das Pellet in 1 ml MSCGM resuspendieren. Führen Sie eine Zellzählung mit einem Hämozytometer oder einem Cellometer durch.
2. Das Volumen ist so einzustellen, dass die Endkonzentration 5 x 10⁵ MSC in 500 μl MSCGM beträgt.
3. Mit einer sterilen Pinzette 6-Well-PET-Transwell-Filter mit 0,4 μm umdrehen und in eine sterile Box geben.
4. 5 x 10⁵ MSC auf die Außenfläche der Filter aussäen. Inkubieren Sie die Filter 1 Stunde lang bei 37 °C und 5 % CO₂
.
5. Sammeln Sie Medien von der Außenfläche des Filters. Zählen Sie die Anzahl der nicht adhärenten MSCs in den Medien. Drehen Sie die Filter mit einer sterilen Pinzette wieder um und legen Sie sie in eine passende 6-Well-Platte mit 3 ml MSCGM.
6. Geben Sie 2 ml MSCGM auf die Innenfläche des Filters (Abbildung 1B). In einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ 24 Stunden erhitzen. Trypsinisieren Sie einen konfluenten 25 cm² Kolben mit EC (Abbildung 1Ai; wie Abschnitt 1.4).
7. Resuspendieren Sie EC in 8 ml MSCGM (1 x 25 cm 2 Kolben säen vier 6-Well-Filter aus; ~5 x 10⁵ EC/Filter). Saugen Sie das Medium von der Ober- und Unterseite der porösen Filter an. Geben Sie 3 ml frisches MSCGM in die untere Kammer (unter dem Filter). Geben Sie 2 ml EC-Suspension auf die Innenfläche jedes Filters. 1 Stunde bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
8. Medium ansaugen, um nicht haftendes EC abzuwaschen und durch frisches MSCGM zu ersetzen. Richten Sie parallele EC-Monokulturfilter ein, indem Sie Zellen auf der Innenfläche aussäen, ohne vorher MSC zu säen. O/N bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
9. Prüfen Sie, ob die EC-Monoschicht konfluent ist und keine Lücken enthält. Subkonfluente Monoschichten können nicht für Adhäsionsassays verwendet werden (Abbildung 1B).
10. 1 x 10⁵ U/ml Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα) auftauen und 1:1.000 in MSCGM auf eine Endkonzentration von 100 U/ml (entspricht ~10 ng/ml) verdünnen. Eine serielle Verdünnung wird durchgeführt, indem 100 U/ml TNFα in MSCGM um 1:10 verdünnt wird, um 10 U/ml zu erhalten. 10 U/ml TNFα um 1:10 in MSCGM verdünnen, um 1 U/ml zu erhalten.
11. Behandeln Sie die obere und untere Kammer der Filter 4 Stunden lang vor dem Assay mit 1, 10 oder 100 U/ml TNFα (entspricht ~10 ng/ml) bei 37 °C.

>3. Isolierung von Leukozyten

1. Entnehmen Sie venöses Blut von gesunden Probanden und aliquotieren Sie es sofort in EDTA-Röhrchen. Drehen Sie die Röhrchen vorsichtig um, um sie zu mischen.
2. Schichten Sie 2,5 ml Histopaque 1077 auf 2,5 ml Histopaque 1119 in einem 10 ml Röhrchen mit rundem Boden. Schichten Sie 5 ml Vollblut auf den histopaken Gradienten. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 40 min bei RT.
3. Gewinnung peripherer polymorphkerniger Neutrophilen (PMN) an der Grenzfläche von Histopaque 1077 und 1119 (oberhalb der Erythrozytenschicht). In eine 10-ml-Tube mit rundem Boden geben und auf 10 ml mit PBSA auffüllen. Das Röhrchen vorsichtig umdrehen und bei 400 x g für 5 min bei RT zentrifugieren.
4. 7,5%ige BSA-Lösung 1:50 in 100 ml PBS (mit Calcium- und Magnesiumchlorid) auf eine Endkonzentration von 0,15 % (w/v; PBSA). Überstand aspirieren und in 10 ml PBSA resuspendieren. Zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei RT.
5. In 1 ml PBSA resuspendieren. Nehmen Sie ein Aliquot von 20 μl der Zellsuspension und geben Sie es zu 380 μl PBSA (1:20 Verdünnung). Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem Cellometer. Auf die erforderliche Konzentration (1 x 10⁶/ml für Transwell-Filter und Ibidi-Objektträger) in PBSA verdünnen. Halten Sie die Neutrophilensuspension bis zum Assay bei RT.

>4. Zusammenbau des Durchflusssystems

1. Richten Sie das Durchflusssystem wie in Abbildung 1C gezeigt ein. Schalten Sie die Heizung ein und stellen Sie sie auf 37 °C ein. Setzen Sie eine 20-ml-Spritze (entfernen Sie den Kolben) und eine 5-ml-Spritze auf einen 3-Wege-Wasserhahn. Befestigen Sie den Gewindebohrer mit Micropore-Klebeband an der Plexiglaskammer.
2. Messen und schneiden Sie ein langes Stück Silikonschlauch mit einer Dicke von 2/4 mm, das ungefähr dem Abstand zwischen dem Ventil und dem 3-Wege-Hahn entspricht. Schneiden Sie ein 8 - 10 mm langes Stück 1/3 mm (dünnen) Schlauch ab und stecken Sie es in ein Ende des dicken Schlauches. Befestigen Sie die dicke Schlauchseite am 3-Wege-Wasserhahn.
3. Verbinden Sie das dünne Schlauchende mit einem Anschluss des elektronischen 3-Wege-Mikroventils. Dies ist das "Wash Reservoir". Schneiden Sie ein 6 - 8 mm langes Stück dicken und dünnen Schlauch ab.
4. Führen Sie den dünnen Schlauch in ein Ende des dicken Schlauchs ein. Befestigen Sie das dicke Schlauchende an einer 2-ml-Spritze (entfernen Sie den Kolben).
5. Verbinden Sie das dünne Schlauchende der 2-ml-Spritze mit einem Anschluss am elektronischen Mikroventil, um das "Probenreservoir" zu bilden. Verbinden Sie das Ventil mit der Filterdurchflusskammer, indem Sie ein langes Stück dünnen Schlauchs messen und schneiden, der dem Abstand zwischen dem Mikroventil und der Mitte des Mikroskoptisches entspricht.
6. Befestigen Sie für das Microslide-Modell ein 8 - 10 mm dickes Stück Schlauch am Ende des dünnen Schlauchs. Platzieren Sie einen L-förmigen Stecker am Ende des dicken Schlauchs. Dadurch wird eine Verbindung zum Mikroobjektträger hergestellt. Befestigen Sie für das Filtermodell ein 8 - 10 mm Stück Portex Blue Line Manometer, das den Schlauch mit dem Ende des dünnen Schlauchs verbindet.
7. Setzen Sie das dünne Schlauchende auf das Mikroventil. Dies ist die übliche Ausgabe für die Wasch- und Probenbehälter. Füllen Sie die Behälter mit PBSA. Entlüften Sie die Schläuche, indem Sie PBSA durch sie fließen lassen, um Luftblasen zu entfernen.
8. Befestigen Sie den Manometer-Schlauch an einer 29 mm (50 ml) Glasspritze. Grundieren Sie die Spritze, indem Sie sie mit 10 ml PBSA füllen. Drehen Sie die Spritze so um, dass das mit dem Schlauch verbundene Ende nach oben zeigt, und drücken Sie alle Luftblasen heraus. Nachfüllen mit 5 ml PBSA.
9. Befestigen Sie nur für das Mikroobjektträgermodell ein 10 - 12 mm dickes Stück Schlauch am Ende des Manometer-Schlauchs, der zur Glasspritze führt. Setzen Sie einen L-förmigen Stecker auf das Ende des dicken Schlauchs. Legen Sie die Glasspritze zur Infusion/Entnahme in eine Spritzenpumpe.
10. Berechnen Sie die Nachfüllflussrate (Q), die erforderlich ist, um die gewünschte Wandschubspannung (τ_w in Pascal, Pa) von 0,1 Pa (Transwell-Filter) oder 0,05 Pa (Ibidi-Objektträger) zu erzeugen, indem Sie die folgenden Formeln verwenden:
    γ_w = (6. Q) / (b.h²)
    τ = n.γ
    Dabei ist w = Innenbreite und h = Innentiefe des Strömungskanals. n = Viskosität der fließenden Lösung; PBSA ist n = 0,7 mPa.s. Für die Strömungskammer des Parallelplattenfilters beträgt die Breite (B) 4 mm und die Tiefe (H) 0,133 mm. Die Tiefe der Kammer kann aufgrund von Unterschieden in der Dicke der verwendeten Parafilm-Dichtung leicht variieren. Für den Ibidi Objektträger beträgt die Breite 3,8 mm und die Tiefe 0,4 mm.
    Anmerkung: Aufgrund von Unterschieden in den Abmessungen des Strömungskanals und der Erfassungsdynamik verwenden wir für das Mikroschiebemodell unterschiedliche Schubspannungen im Vergleich zum Filtermodell.

>5. Einrichten der Parallelplatten-Durchflusskammer mit Filtern

1. Schneide ein Stück Parafilm (in der gleichen Größe wie das Glasdeckglas) mit einer Metallschablone aus. Schneiden Sie mit einer Metallschablone einen 20 x 4 mm großen Schlitz in den Parafilm aus (um den Strömungskanal zu erstellen). Verwenden Sie die Dichtung, um den Strömungskanal auf dem Glasdeckglas zu markieren.
2. Richten Sie die Ränder des 6-Well-Filters auf dem Glasdeckglas aus. Stellen Sie sicher, dass der Filter die Markierungen der Strömungskanäle abdeckt. Schneiden Sie den Filter vorsichtig mit einem Skalpell vom Typ 10A aus.
3. Decken Sie den Filter vorsichtig mit einer Parafilm-Dichtung ab und stellen Sie sicher, dass sich der Strömungskanalschlitz in der Mitte des Filters befindet (Abbildung 1D). Verwenden Sie ein Stück sauberes Taschentuch und drücken Sie alle Blasen heraus.
4. Legen Sie das Deckglas in die Aussparung der Bodenplatte der Plexiglas-Durchflusskammer. Positionieren Sie die obere Plexiglasplatte über der Oberseite der Dichtung und verschrauben Sie die Platten miteinander (Abbildung 1D).
5. Drehen Sie den 3-Wege-Hahn, damit der Waschpuffer (PBSA) durch das Ventil fließen kann. Verbinden Sie den Manometerschlauch mit der Einlassöffnung der oberen Plexiglasplatte. Führen Sie PBSA durch den Durchflusskanal, damit Blasen passieren können.
6. Verbinden Sie den Manometerschlauch von der Spritzenpumpe mit dem Auslassanschluss der Plexiglasplatte. Stellen Sie die Spritzenpumpe auf Nachfüllen ein und drücken Sie auf Ausführen. Reinigen Sie PBSA, das auf die obere Platte der Kammer getropft ist.
7. Stellen Sie die Kammer auf den Tisch eines inversen Phasenkontrastmikroskops. Passen Sie den Fokus an, um den EC über den Filtern zu visualisieren (Abbildung 1B).

>6. Perfusion von Leukozyten über Endothelzellen

1. Geben Sie 2 ml gereinigte Neutrophile in das Probenreservoir und lassen Sie es 2 Minuten lang erwärmen. Waschen Sie das Endothel 2 Minuten lang mit PBSA.
2. Schalten Sie das Ventil ein, um Neutrophile über dem Endothel zu perfundieren. Geben Sie den neutrophilen Bolus für 4 Minuten ab. Schalten Sie das Ventil aus und perfundierten Sie PBSA für den Rest des Experiments aus dem Waschbehälter.
3. Stellen Sie sicher, dass zu keinem Zeitpunkt des Assays Luftblasen durch den Strömungskanal gelangen, da dies die EC-Monoschicht stört und zu einer Ablösung der adhärenten Neutrophilen führt.

>7. Aufnahme und Verhalten von Neutrophilen

aufzeichnen

1. Erfassen Sie die Rekrutierung von Neutrophilen entweder während des Neutrophilenflusses oder nach der Perfusion.
2. Machen Sie alle digitalen Aufzeichnungen von mindestens 5 - 10 Feldern in der Mitte des Strömungskanals. Identifizieren Sie die Mitte des Kanals, indem Sie das Objektiv an den Rand des Kanals an der Einlassöffnung bewegen und die Mitte der Öffnung identifizieren.
   1. Für die Aufzeichnung während des Neutrophilenflusses nehmen Sie 1 Minute lang alle 10 Sekunden Bilder eines einzelnen Feldes auf. Bewegen Sie sich entlang des Kanals und nehmen Sie ein anderes Feld 1 Minute lang auf. Wiederholen Sie dies für die Dauer des Bolus.
   2. Für die Aufzeichnung nach der Perfusion machen Sie 10-Sekunden-Aufzeichnungen von 5 - 10 Feldern in der Mitte des Flusskanals, um das Verhalten von Leukozyten zu beurteilen (typischerweise 2 Minuten nach dem Ende des Neutrophilenbolus). Nehmen Sie innerhalb des 10-Sekunden-Intervalls jede Sekunde Bilder auf. Dies gibt ausreichend Zeit für die Erfassung aus der Strömung und das Verhalten der adhärenten Neutrophilen, die analysiert werden sollen.
   3. Nehmen Sie 5 Minuten lang ein einzelnes Feld mit mindestens 10 transmigrierten Neutrophilen auf und nehmen Sie alle 30 Sekunden Bilder auf. Dies kann verwendet werden, um die Geschwindigkeit von migrierten Zellen (entweder über oder unter dem Endothel) zu berechnen.
   4. Nehmen Sie eine weitere Serie von 10-Sekunden-Feldern auf (in der Regel 9 Minuten nach der Perfusion). Dies gibt den Neutrophilen Zeit, durch die endotheliale Monoschicht zu wandern.
   5. Stoppen Sie die Spritzenpumpe und entfernen Sie den Schlauch. Zerlegen Sie die Durchflusskammer und spülen Sie das Probenreservoir und die Schläuche. Wiederholen Sie den Vorgang für nachfolgende Filter/Mikroschiebekanäle.

>8. Analyse der Rekrutierung und des Verhaltens von Leukozyten

1. Zählen Sie die Anzahl der Neutrophilen in jedem Feld während der 10-Sekunden-Aufzeichnungen zum Zeitpunkt von 2 Minuten. Alle Zellen müssen im Feld "Erst-Zweite" vorhanden sein, um gezählt zu werden. Zellen, die sich auf 2 Seiten (z.B. oberer/rechter Rand) des Sichtfeldes teilweise im Feld befinden, werden in die Zählung einbezogen, solange sie die vollen 10 Sekunden im Feld verbleiben.
2. Berechnen Sie die mittlere Anzahl adhärenter Neutrophilen pro Feld. Messen Sie die Länge und Breite des aufgezeichneten Feldes. Berechnen Sie die Fläche des Feldes. Berechnen Sie, wie viele Felder in 1 mm² vorhanden sind. Multipliziere die mittlere Anzahl der Neutrophilen mit der Anzahl der Felder in 1 mm².
3. Berechnen Sie die Gesamtzahl der perfundierten Neutrophilen, indem Sie die Menge der perfundierten Neutrophilen (z. B. 2 x 10⁶/ml*Q [z. B. 0,0999 ml/min für eine parallele Platten-Flow-Kammer]) mit der Dauer des Bolus (z. B. 4 min) multiplizieren.
4. Die Anzahl der Neutrophilen/mm² wird durch die Gesamtzahl der perfundierten Neutrophilen dividiert, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen, die adhärent sind (adhärente Zellen/mm² / 10,⁶ perfundiert).
5. Beurteilen Sie, ob die adhärenten Neutrophilen rollend, fest haftend oder transmigriert sind.
   1. Ein rollendes Neutrophil ist phasenhell und bewegt sich langsam entlang der endothelialen Monoschicht (1 - 10 μm/sec).
   2. Fest haftende Zellen sind phasenhell und an die EC-Oberfläche gebunden, bleiben entweder stationär (d.h. bewegen sich während der Aufnahme nicht) oder haben eine Formänderung durchlaufen und wandern über die EC-Oberfläche (Abbildung 1Ei).
   3. Ein transmigrierter Neutrophiler ist phasendunkel und unterhalb der EC-Schicht (Abbildung 1Eii).
6. Berechnen Sie den Prozentsatz der adhärenten Zellen, die rollend, stationär und transmigriert sind. Alternativ kann das Verhalten von Neutrophilen als Gesamtzahl der Zellen ausgedrückt werden, die die unterschiedlichen Verhaltensweisen aufweisen, indem die gleiche Formel angewendet wird, die zur Berechnung der Gesamtadhäsion verwendet wird (wie in den Schritten 8.6 - 8.7 beschrieben).
   1. Markieren Sie die Vorderkante eines rollenden Neutrophilen. Markieren Sie die Vorderkante derselben Zelle am Ende der 10-Sekunden-Sequenz. Zeichnen Sie eine Linie zwischen den 2 Punkten und messen Sie die Entfernung, die die Zelle zurückgelegt hat.
   2. Teilen Sie diesen Wert durch die Dauer der Aufzeichnung, in der die Zelle rollt (d. h. 10 Sekunden). Versuchen Sie, Neutrophile auszuwählen, die sich während des gesamten 10-Sekunden-Intervalls im Feld befinden.
7. Um die Geschwindigkeit von Neutrophilen zu berechnen, die über die Oberfläche (geformt, veränderte Phase, hell) oder unter dem Endothel (Phase dunkel) wandern, verwenden Sie die 5-Minuten-Aufzeichnung.
   1. Zeichnen Sie einen Umriss der migrierten Zellen am Anfang der Sequenz, und verfolgen Sie deren Bewegungen in der gesamten Sequenz. Notieren Sie sich die X- und Y-Positionen des Schwerpunkts in jedem 1-Minuten-Intervall für jede Zelle. Subtrahieren Sie die Werte der X- und Y-Positionen vom ersten Bild der Sequenz von den Werten im zweiten Bild. Dies basiert auf dem Satz des Pythagoras.
   2. Subtrahieren Sie die Werte vom zweiten Bild vom dritten Bild. Tun Sie dies für alle Bilder in der Sequenz. Quadrieren Sie die X- und Y-Werte, und addieren Sie sie.
   3. Quadratwurzel des resultierenden Werts. Berechnen Sie die Geschwindigkeit für jede Zelle, indem Sie den Durchschnitt der Geschwindigkeiten bilden, die in jedem Minutenintervall berechnet werden. Verfolgen Sie 10 migrierte Neutrophile und berechnen Sie die mittlere Geschwindigkeit.

Ergebnisse

Abbildung 1. Etablierung einer EC-MSC-Co-Kultur und Analyse der Rekrutierung von Neutrophilen unter Verwendung eines flussbasierten Adhäsionsassays. (A) Mikroskopische Aufnahme von (i) primärem EC und (ii) Passage 3 BMMSC, gezüchtet auf Gewebekulturflaschen. (B) Mikroskopische Aufnahme von EC und MSC, kultiviert auf 6-Well-Transwell-Filtereinsätze...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagenase Typ Ia	Sigma	Nr. C2674	In 10 ml PBS verdünnen, um eine Endkonzentration von 10 mg/ml zu erhalten. Bei -20 °C in 1 ml Aliquoten lagern.
Dulbecco's PBS	Sigma	Nr. D8662	Mit Calcium- und Magnesiumchlorid. Steril aufbewahren und bei Raumtemperatur lagern.
1X Mittel M199	Gibco	Artikel-Nr.: 31150-022	Vor Gebrauch im 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
Gentamicinsulfat	Sigma	Nr. G1397	Bei 4 °C lagern. In die Flasche M199 500 ml geben.
Humaner epidermaler Wachstumsfaktor	Sigma	Nr. E9644	Bei -20 °C in 10 μl Aliquoten lagern.
Fötales Kälberserum (FCS)	Sigma	Nr. F9665	FCS muss chargenweise getestet werden, um das Wachstum und die Lebensfähigkeit der isolierten EC zu gewährleisten. Hitze inaktivieren bei 56 °C. In 10-ml-Aliquoten bei -20 °C lagern.
Amphotericin B	Gibco	Tel.: 15290-026	Stark und wird innerhalb einer Woche giftig, daher muss jede Woche frisches, komplettes HUVEC Medium hergestellt werden. Bei -20°C in 1ml Aliquots lagern.
Hydrocortison	Sigma	Nr. H0135	Der Lagerbestand ist in Ethanol enthalten. Bei -20 °C in 10 μl Aliquoten lagern.
Kollagenase Typ II	Sigma	Nr. C6885	Das Material in PBS auf eine Endkonzentration von 100 mg/ml verdünnen. Bei -20 °C in 100 μl Aliquoten lagern.
Hyaluronidase	Sigma	Nr. H3631	Verdünnen Sie das Material in PBS auf eine Endkonzentration von 20.000 U/ml. Lagern Sie es bei -20 °C in 100 μl Aliquoten.
100μm Zellsieb für 50ml Zentifugenröhrchen	Wissenschaftlicher Laborbedarf (SLS)	Artikel-Nr.: 352360	Es können auch andere kommerziell erhältliche Zellsiebe (z.B. Greiner bio-one) verwendet werden.
DMEM niedriger Glukosespiegel	Bioseren	LM-D1102/500	Vor Gebrauch im 37 °C warmen Wasserbad erwärmen.
Penicillin/Streptomycin-Mischung	Sigma	Nr. P4333	Bei -20°C in 1ml Aliquots lagern.
25 cm2 Gewebekulturkolben	sls	353109
75 cm2 Gewebekulturkolben	sls	353136
Fläschchen für mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks	Lonza	PT-2501	Bei der Ankunft in flüssigem Stickstoff lagern. Die Zellen befinden sich bei der Ankunft im Durchgang 2, sind aber als Durchgang 0 gekennzeichnet. Den Durchgang 3 öffnen und für die spätere Verwendung in flüssigem Stickstoff lagern.
Wachstumsmedium für mesenchymale Stammzellen (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Vor Gebrauch im 37 °C warmen Wasserbad erwärmen. Verwenden Sie für die Cell Tracker Grünfärbung Medium ohne FCS.
EDTA (0,02%) Lösung	Sigma	Nr. E8008	Bei 4°C lagern. Vor Gebrauch im 37°C Wasserbad erwärmen.
Trypsin-Lösung	Sigma	Nr. T4424	Bei -20°C in 2ml Aliquots lagern. Bei Raumtemperatur auftauen und sofort verwenden.
Kryo-Fläschchen	Greiner bio-one	2019-02	Vor dem Hinzufügen auf Eis halten, bevor Sie die Zellsuspension hinzufügen.
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Nalgene	Artikel-Nr.: 5100-0001	Bei Raumtemperatur lagern. Beim Hinzufügen von Kryofläschchen mit Zellen 24 Stunden lang bei -80 °C lagern, bevor die Zellen in flüssigen Stickstoff umgewandelt werden.
Cell Tracker grüner Farbstoff	Lebenstechnologien	Nr. C2925	In 5 μl Aliquoten bei -20 °C lagern. In 5 ml vorgewärmtem (bei 37 °C) MSCGM verdünnen.
Zellzählkammern	Nexcelom	SD-100	Alternativ kann ein Hämozytometer verwendet werden.
Cellometer auto T4 Zellenzähler	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumornekrosefaktor α (TNFα)	F&E-Systeme	Artikel-Nr.: 210-TA-100	Verdünnen Sie das Material in PBS auf eine Endkonzentration von 100.000 U/ml. Lagern Sie es bei -80 °C in 10 μl Aliquoten.
6-Well-PET-Transwell-Filter mit 0,4 μm	sls	Artikel-Nr.: 353090
K2-EDTA in 10ml Tuben	Sarstedt		Bei Raumtemperatur lagern.
Histopaque 1119	Sigma	Artikel-Nr.: 11191	Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
Histopaque 1077	Sigma	Artikel-Nr.: 10771	Bei 4 °C lagern. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen.
10 ml Tube mit rundem Boden	Appleton Woods	SC211 142 AS
7,5 % BSA-Lösung der Fraktion V	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 15260-037	Bei 4°C lagern.
20ml Plastipak Spritzen	BD Falke	300613
5 ml Plastipak Spritzen	BD Falke	302187
2ml Plastipak Spritzen	BD Falke	300185
3M hypoallergenes chirurgisches Klebeband 9m x 2,5cm	Mikroporen	Nr. 1530-1	Verwenden Sie diese Option, um den Spritzengewindebohrer an der Wand der Plexiglaskammer zu befestigen.
Silikonkautschukschlauch, Innendurchmesser/Außendurchmesser (ID/AD) von 1/3mm (dünner Schlauch)	Fisher Scientific	FB68854	Schneiden Sie den Silikonschlauch auf die entsprechende Größe zu. Alle Schläuche, die direkt zum elektronischen Mikroventil führen, müssen dünn sein.
Silikonkautschukschlauch ID/AD von 2/4 mm (dicker Schlauch)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer-Schläuche	Smiths	Tel.: 200/495/200	Schlauch, der zur Spritzenpumpe führt.
3-Wege-Absperrhahn	BOC Ohmeda AB
Glas 50ml Spritze für Pumpe	Popper Micromate	550962	Muss vor der Verwendung grundiert werden, indem Luftblasen entfernt werden.
Glas-Deckglas	Raymond A Lamm		26x76mm Deckgläser auf Bestellung. Losnummer 2440980.
Parafilm Dichtung	Amerikanische National Can Company		Schneiden Sie ein 26x76mm Stück Parafilm mit einer Aluminiumschablone und schneiden Sie mit einem Skalpell 10a einen 20x4mm Schlitz hinein. Die Dichtungsdicke beträgt ca. 133μm.
Zwei parallele Plexiglasplatten	Wolfson Labor für angewandte Technologie		Speziell entwickelte Kammer, die aus parallelen Platten besteht, die von 8 Schrauben zusammengehalten werden. Die untere Platte hat in der Mitte einen Sichtschlitz ausgeschnitten und eine flache Aussparung, die gefräst ist, um Platz für Deckglas, Filter und Dichtung zu schaffen. Die obere Plexiglasplatte hat eine Ein- und Auslauföffnung, die über dem Strömungskanal positioniert ist.
Elektronisches 3-Wege-Mikroventil mit min. Totraum	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Elektronisch verbunden mit einem 12 Volt Gleichstromnetz.
Spritzenpumpe für Infusion/Entnahme (PHD2000)	Harvard-Apparatur	Nr. 70-2001	Stellen Sie den Durchmesser auf 29 mm und die Nachfüllmenge (Durchflussmenge) ein.
L-förmiger Stecker	Labhut	LE876	Zur Befestigung an den Einlass- und Auslassöffnungen des Ibidi Microslide-Kanals.
Videokamera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Verbunden mit einem Computer, mit dem digitale Videos aufgezeichnet werden können.
Image-Pro Plus 7.0	Medienkybernetik	Artikel-Nr.: 41N70000-61592	Für die Datenanalyse. Markieren Sie Zellen manuell, in denen die verschiedenen Verhaltensweisen angezeigt werden. Verfolgen Sie Zellen zur Analyse von Roll- und Migrationsgeschwindigkeiten.