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>1. Induktion der Seneszenz durch Chemotherapeutika in kultivierten Krebszellen
HINWEIS: Alle Schritte zur Zellmanipulation in diesem Abschnitt sollten in einer Biosicherheitswerkbank unter Verwendung steriler Verfahren durchgeführt werden. Dieser Abschnitt ist für adhärente Zelltypen geschrieben. Suspensionszellen können mit entsprechenden Modifikationen wie angegeben verwendet werden.
- Züchten Sie Krebszelllinien(n) gemäß dem Standardprotokoll des Lieferanten oder des Labors, das die verwendete(n) spezifische(n) Zelllinie(n) bereitgestellt hat.
Anmerkung: Zellen mit niedriger Passage (p < 10) werden im Allgemeinen bevorzugt, da es in unbehandelten Zellproben eine geringere replizative Seneszenz, d.h. einen geringeren Hintergrund, gibt.
- Einen Tag vor der Seneszenzinduktion durch Medikamente entnehmen Sie Zellen mit Trypsin-EDTA 0,25 % (oder wie empfohlen). Neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen des vollständigen Kulturmediums hinzufügen und die Zellsuspension in ein steriles konisches Röhrchen überführen.
Anmerkung: Dieser Schritt ist für Suspensionszellen nicht erforderlich.
- Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Hämazytometer-Methode und zeichnen Sie die Zellen/ml auf. Plattenzellen bei 1 × 10 3-10 × 103 Zellen/cm2 in Standard-6-Well-Kunststoffkulturschalen.
Anmerkung: Die optimale Plattierungsdichte hängt von der Proliferationsrate der Zellen ab und sollte vom Benutzer bestimmt werden. Die Zellen sollten sich zum Zeitpunkt der Behandlung (d. h. nach einer 18-24-stündigen Inkubation nach der Plattierung) in der logarithmischen Phase mit einer Konfluenz von etwa 10 % bis 20 % befinden. Die Ausgangsdichte (Zellen/ml) von Suspensionszellen sollte vom Benutzer bestimmt werden. Sechs-Well-Platten ergeben in der Regel genügend seneszente Zellen pro Well für eine Standard-Durchflusszytometrie-Analyseprobe. Bei der Flow-Sortierung sollte eine viel größere Oberfläche (z. B. mehrere P150-Platten) verwendet werden, um die Rückgewinnung einer ausreichenden Anzahl seneszenter Zellen für nachgeschaltete Assays zu ermöglichen (≥1 × 106).
- Inkubieren Sie die plattierten Zellen über Nacht (18-24 h) in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 und einer Feuchtigkeitsschale.
- Behandeln Sie die plattierten Zellen mit Seneszenz-induzierenden Chemotherapeutika. Schließen Sie mindestens eine Positivkontrolle ein, z. B. Etoposid (ETO) oder Bleomycin (BLM). Bereiten Sie doppelte Wells pro Medikament vor. Fügen Sie einen Satz hinzu, der nur mit dem Fahrzeug als control behandelt wurde.
Anmerkung: Der Anwender sollte eine Dosiskurve für jedes Versuchsmittel testen, um die optimale Konzentration für die Seneszenzinduktion in der verwendeten Zelllinie(n) zu bestimmen.
- Inkubieren Sie die Zellen 4 Tage lang in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO2 und einer Feuchtigkeitsschale, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Täglich mit einem Lichtmikroskop auf zu erwartende morphologische Veränderungen untersuchen.
Anmerkung: Inkubationszeiten von 3-5 Tagen können je nach Rate des Beginns der Seneszenz akzeptabel sein. Das Medium kann wie gewünscht gewechselt und das Mittel erneut angewendet werden (oder auch nicht), um gesunde Wachstumsbedingungen zu fördern und gleichzeitig einen akzeptablen Prozentsatz an seneszenten Zellen zu erreichen.
- Nach dem Einsetzen der Seneszenz ernten Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin-EDTA 0,25 % für 5 Minuten bei 37 °C. Wenn Zellen in Suspension dissoziiert werden, neutralisieren Sie Trypsin mit dem gleichen Volumen des vollständigen Mediums.
Anmerkung: Dieser Schritt ist für Zellen, die in Suspension wachsen, nicht erforderlich. Wenn eine Oberflächenmarkerfärbung durchgeführt wird, vermeiden Sie die Verwendung von Trypsin-EDTA, da es Oberflächenantigene auf Zellen vorübergehend zerstören kann. Dissoziieren Sie die Monoschicht stattdessen vorsichtig mit einem sterilen Zellschaber aus Kunststoff (oder einem alternativen Dissoziationsreagenz, das zur Konservierung von Oberflächenantigenen entwickelt wurde).
- Zählen Sie die Zellen in jeder Probe mit einem Hämazytometer. Berechnen Sie die Zellen/ml für jede Probe.
Anmerkung: Trypanblau kann hinzugefügt werden, um den Prozentsatz toter Zellen zu diesem Zeitpunkt (d. h. aufgrund einer medikamentösen Behandlung) zu bewerten, aber der Zelltod wird auch mit einem fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff während des DDAOG-Färbeablaufs bestimmt.
- Aliquot ≥0,5 × 106 Zellen pro Probe in 1,7 mL Mikrozentrifugenröhrchen.
Anmerkung: Die Anzahl der Zellen pro Probe sollte über alle Proben hinweg standardisiert werden.
- Die Röhrchen werden 5 min lang bei 1.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand entfernen.
Anmerkung: Wenn keine gekühlte Mikrozentrifuge verfügbar ist, kann es akzeptabel sein, Zentrifugationen bei Umgebungstemperatur für bestimmte elastische Zelltypen durchzuführen.
- Fahren Sie mit der DDAOG-Färbung in Abschnitt 2 fort.
>2. DDAOG-Färbung von SA-β-Gal in Zellproben
- 1 mM Bafilomycin A1-Stamm im Verhältnis 1:1.000x in DMEM-Medium (ohne FBS) verdünnen, um eine Endkonzentration von 1 μM zu erreichen.
- Den Zellpelletproben (aus Schritt 1.11) wird die vorbereitete Baf-DMEM-Lösung in einer Konzentration von 1 × 106 Zellen/ml.
Anmerkung: Wenn Sie z. B. 0,5 × 106 Zellen pro Probe verwenden, fügen Sie 0,5 ml Baf-DMEM hinzu.
- 30 min bei 37 °C (ohne CO2) auf einem Rotator/Shaker inkubieren, der auf langsame Geschwindigkeit eingestellt ist.
Anmerkung: Vermeiden Sie CO2 -Inkubatoren für den Färbeprozess, die Lösungen ansäuern und dadurch die Baf- und DDAOG-Färbung beeinträchtigen können.
- Geben Sie ohne Waschen die DDAOG-Stammlösung (5 mg/ml) in einer Dosierung von 1:500x (10 μg/ml endgültig) zu jeder Probe. Pipette zum Mischen. Auf einem Rotator/Shaker bei 37 °C (ohne CO2) für 60 min austauschen. Vor direkter Lichteinstrahlung schützen.
- Die Röhrchen werden 5 min lang bei 1.000 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt.
- Mit 1 ml eiskaltem 0,5 % BSA pro Röhrchen waschen und mit der Pipette mischen. Die Röhrchen 5 min bei 1.000 x g bei 4 °C zentrifugieren und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt 2x, um die Zellen gründlich zu waschen. Entfernen Sie den Überstand und fahren Sie fort.
Anmerkung: Es ist wichtig, die Waschschritte in Schritt 2.6 durchzuführen, um ungespaltenes DDAOG zu entfernen, das eine unerwünschte Fluoreszenzemission (460/610 nm) aufweisen kann.
- (Optional) Fixierung und Lagerung von DDAOG-gefärbten Zellen für die spätere Analyse
- Geben Sie 0,5 ml eiskaltes 4%iges Paraformaldehyd tropfenweise in jede gewaschene Probe. Pipette zum Mischen.
- 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie die Zellen 2x mit 1 mL PBS.
- Lagern Sie die Proben bis zu 1 Woche bei 4 °C, bevor Sie mit der Durchflusszytometrie beginnen.
Anmerkung: Für feste Stichproben überspringen Sie Schritt 2.8.
- Verdünnen Sie das Calcein Violet 450 AM-Material (1 mM) im Verhältnis 1:1.000x zu 1 % BSA-PBS (1 μM final). 300 μl (für kultivierte Zellproben) werden zu den gewaschenen Zellpellets aus Schritt 2.6 gegeben. 15 min im Dunkeln auf Eis inkubieren.
- Fahren Sie mit der Einrichtung der Durchflusszytometrie fort (Abschnitt 3).
>3. Einrichtung und Datenerfassung des Durchflusszytometers
- Übertragen Sie die Zellproben in Röhrchen, die mit dem Durchflusszytometrie-Instrument kompatibel sind. Legen Sie die Röhren auf Eis und bewahren Sie sie lichtgeschützt auf.
Anmerkung: Wenn Aggregate in den Zellsuspensionen beobachtet werden, ist die Suspension vor der Analyse durch 70-100 μm Zellsiebe zu leiten. Verwenden Sie keine 40-μm-Siebe, da diese einige der größeren seneszenten Zellen ausschließen können.
- Öffnen Sie in der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) die folgenden Diagramme: 1) Punktdiagramm von FSC-A vs. SSC-A, 2) Histogramm des violetten Kanals, 3) Punktdiagramm des dunkelroten Kanals (z. B. APC-A) im Vergleich zum grünen Kanal (z. B. FITC-A)
Anmerkung: Doublet-Ausschlussdiagramme und Einkanal-Histogramme können ebenfalls verwendet werden, sind aber nicht zwingend erforderlich.
- Initiieren Sie die Erfassung von Zytometerdaten.
- Legen Sie die mit DDAOG gefärbte Fahrzeugkontrollprobe auf die Einlassöffnung. Beginnen Sie bei niedriger Aufnahmegeschwindigkeit mit der Erfassung von Probendaten.
- Passen Sie die FSC- und SSC-Spannungen so an, dass >90 % der Ereignisse im Diagramm enthalten sind. Wenn Zellen nicht gut in das Diagramm passen, verringern Sie die Einstellung für die Flächenskalierung auf 0,33 bis 0,5 Einheiten.
- Entnehmen Sie die reine Fahrzeugprobe, ohne Daten aufzuzeichnen.
- (Optional) Geben Sie einen Tropfen Regenbogen-Kalibrier-Mikrosphären in ein Zytometerröhrchen mit 1 ml PBS. Setzen Sie den Schlauch auf die Einlassöffnung des Zytometers. Beginnen Sie mit dem Erfassen von Beispieldaten.
- Passen Sie die violetten, grünen und dunkelroten Kanalspannungen so an, dass der obere Peak der Regenbogen-Mikrosphäre in jedem Kanal im Bereich von 104 bis 105 Einheiten relativer Fluoreszenz liegt und alle Peaks in jedem Kanal gut voneinander getrennt sind. Zeichnen Sie 10.000 Ereignisse auf. Entfernen Sie den Schlauch.
- Die mit DDAOG gefärbte Positivkontrollprobe (z. B. BLM, ETO) auf die Einlassöffnung legen. Erfassen Sie mit niedriger Geschwindigkeit Beispieldaten. Beobachten Sie die Ereignisse in den Kanälen FSC, SSC, violett, grün und dunkelrot, um sicherzustellen, dass mehr als 90 % der Ereignisse in allen Diagrammen enthalten sind. Achten Sie auf eine Erhöhung des AF- und DDAOG-Signals im Vergleich zur reinen Fahrzeugsteuerung.
- Wenn Sie ein Sortierzytometer verwenden, starten Sie die Sortierung in diesem Schritt.
- Zeichnen Sie zu Aufzeichnungszwecken 10.000 Zellen für die Kontrollprobe und jede sortierte Probe auf.
- Sortieren Sie die gewünschte Menge an Zellen (≥1 × 106 ist typischerweise geeignet) in ein instrumentengeeignetes Entnahmeröhrchen mit 3-5 mL Kulturmedium.
- Fahren Sie nach dem Sortieren mit der nachgelagerten Kultur oder Analyse fort.
Anmerkung: Für das kalibrierte Durchflusszytometer, das hierin verwendet wird, fielen die optimalen Kanalspannungen typischerweise zwischen 250 und 600 (mittlerer Bereich), aber die optimalen Spannungen und Kanalspannungsbereiche variieren zwischen den Instrumenten. Vermeiden Sie die Verwendung von Spannungen in sehr niedrigen oder hohen Bereichen, die das Signal unterdrücken oder das Rauschen verstärken können.
- Nachdem Sie die Schritte 3.1 bis 3.5 abgeschlossen und die Zytometereinstellungen bei Bedarf angepasst haben, zeichnen Sie die Daten für alle Proben auf. Stellen Sie sicher, dass die Einstellungen für alle Beispielaufnahmen einheitlich bleiben. Aufzeichnung von ≥10.000 Ereignissen pro kultivierter Zellprobe.
Anmerkung: Obwohl Gating und Analyse unter Verwendung von Datenerfassungssoftware (z. B. FACSDiva) durchgeführt werden können, wird in Abschnitt 4 unten ein vollständiger Gating- und Analyse-Workflow beschrieben, der nach der Erfassung unter Verwendung einer separaten Analysesoftware (FlowJo) durchgeführt werden muss. Die Analyse nach der Aufnahme wird bevorzugt, um die Zeit am Zytometer-Arbeitsplatz zu verkürzen und die Vorteile der zusätzlichen Tools zu nutzen, die in der speziellen Analysesoftware enthalten sind.
- Speichern Sie Beispieldaten im .fcs-Dateiformat. Exportieren Sie die Dateien auf einen Workstation-Computer, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware (z. B. FlowJo) ausgestattet ist.
>4. Datenanalyse der Durchflusszytometrie
HINWEIS: Der vorgestellte Workflow verwendet die FlowJo-Software. Eine alternative Datenanalysesoftware für die Durchflusszytometrie kann verwendet werden, wenn die in diesem Abschnitt beschriebenen wichtigen Schritte in ähnlicher Weise befolgt werden.
- Öffnen Sie mit der FlowJo-Software die .fcs-Datendateien aus Schritt 3.7.
- Öffnen Sie das Layoutfenster.
- Ziehen Sie alle Samples per Drag & Drop in das Layout-Fenster.
- Gate lebensfähige Zellen.
- Doppelklicken Sie zunächst auf die Beispieldaten für das reine Fahrzeug-Steuerelement, um das Datenfenster zu öffnen.
- Visualisieren Sie die Daten als Histogramm mit violettem Kanal. Identifizieren Sie die lebensfähigen Zellen, die mit CV450 gefärbt wurden, anhand ihrer helleren Fluoreszenz als die toten Zellen.
- Zeichnen Sie mit dem Histogramm-Werkzeug mit einem Tor ein Tor, um nur lebensfähige Zellen einzuschließen. Benennen Sie das Tor lebensfähig.
- Ziehen Sie dann aus dem Probenlayoutfenster das funktionsfähige Gate auf die anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden.
- Visualisieren Sie im Layout-Fenster alle Proben als Histogramme mit violettem Kanal (Viabilität). Stellen Sie sicher, dass das Gating lebensfähiger Zellen für alle Proben geeignet ist, bevor Sie fortfahren. Wenn nicht, nehmen Sie bei Bedarf Anpassungen vor.
Anmerkung: Die Viabilitätsfärbung kann je nach Behandlung variieren.
- Tor seneszente Zellen.
- Doppelklicken Sie auf die Gated Viable Cell-Daten für das reine Fahrzeug-Steuerelement, um das Datenfenster zu öffnen.
- Visualisieren Sie die Daten als Punktdiagramm für den dunkelroten Kanal (DDAOG) und den grünen Kanal (AF).
- Zeichnen Sie mit dem Rechteck-Gating-Werkzeug ein Tor, um <5 % der Zellen mit DDAOG+ und AF+ (oberer rechter Quadrant) einzuschließen. Nennen Sie das Tor seneszent.
- Ziehen Sie dann aus dem Probenlayout-Fenster das seneszente Gate auf die lebensfähigen Teilmengen der anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden.
- Ziehen Sie alle in Abschnitt 4.4 definierten Teilmengen lebensfähiger Zellen in das Layout-Fenster und legen Sie sie dort ab. Visualisieren Sie alle brauchbaren Proben als Punktdiagramme mit dunkelrotem (z. B. APC-A) und grünem Kanal (z. B. FITC-A).
- Es ist sicherzustellen, dass das in Schritt 4.5.3 gezeichnete seneszente Tor auf allen Diagrammen sichtbar ist und dass das Tor für die reine Fahrzeugkontrolle ≤5 % bis 10 % seneszente Zellen aufweist.
- Nachdem der Prozentsatz der seneszenten Zellen mit den obigen Schritten bestimmt wurde, präsentieren Sie die resultierenden Daten mit den FlowJo-Diagrammen, zusammengefasst in einer Datentabelle und/oder statistisch analysiert mit Standardsoftware.