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>1. Vorbereitung von Reagenzien
- Gallensalze Medium: Zur Herstellung von tryptischer Sojabrühe (TSB) mit 0,4 % Gallensalzen (Gewicht/Volumen) resuspendieren Sie 200 mg Gallensalze in 50 ml autoklaviertem TSB. Der Filter sterilisiert mit einem 0,22 μm Filter. Wöchentlich frisch medium zubereiten.
Notizen: Das routinemäßig verwendete Gallensalz ist ein 1:1-Gemisch aus Natriumcholat und Natriumdesoxycholat, das aus der Gallenblase von Schafen und Rindern isoliert wird. Wie bereits gezeigt, war das Vorhandensein von Glukose für die durch Gallensalz induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Verhältnis zur Luria-Bertani (LB)-Brühe hinzugefügt; und war daher ausreichend, um die Biofilmbildung in Shigella und den anderen analysierten enterischen Krankheitserregern zu induzieren. Abhängig von den zu analysierenden Bakterien können unterschiedliche Glukosekonzentrationen oder ein unterschiedlicher Zuckerbedarf erforderlich sein.
- 0,5 % w/v Kristallviolett in Wasser: Lösen Sie 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auf. Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren.
>2. Vorbereitung von Bakterien
- Züchten Sie über Nacht Kulturen der zu testenden Bakterienstämme, indem Sie 3 ml TSB mit einer einzelnen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kulturröhrchen beimpfen. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 225 U/min für die Inkubation über Nacht (16 - 24 h).
Anmerkung: Die Stämme sollten alle 2 bis 4 Wochen aus dem Gefrierschrank entnommen und auf Platten aufbewahrt werden, die nicht älter als 2 Wochen sind.
>3. Festphasen-Adhärenz-Assay
HINWEIS: Dieser Assay quantifiziert adhärente Bakterien mit einer 96-Well-Plattenmethode. Bakterien werden statisch in flachen Bodenplatten gezüchtet. Das Waschen wird durchgeführt, um nicht anhaftende Bakterien zu entfernen, und anhaftende Bakterien werden mit Kristallviolett gefärbt. Die Kristallviolettfärbung bindet Peptidoglycan in der bakteriellen Zellwand und kann mit Ethanol solubilisiert werden. Die Anzahl der anhaftenden Bakterien wird anhand der Kristallviolett-Retention bestimmt.
- Stellen Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen auf. Markieren Sie mit TSB oder TSB + Gallensalze (BS).
- Geben Sie 1 mL TSB oder TSB + BS in die jeweiligen Röhrchen.
- Die Röhrchen werden mit 20 μl Übernachtkultur (in einer Verdünnung von 1:50) beimpft.
- Geben Sie in einer sterilen, durchsichtigen, mit Gewebekulturen behandelten 96-Well-Platte mit klarem Boden und flachem Boden 130 μl/Well unbeimpftes Kontrollmedium in drei Wells, die als Blindkontrolle dienen. Richten Sie für jeden zu testenden Medientyp (TSB und TSB + BS) drei Kontrollvertiefungen ein.
- Geben Sie 130 μl/Vertiefung der inokulierten Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Versuchsbedingungen in dreifacher Ausfertigung plattiert sind.
- 4 - 24 h bei 37 °C statisch inkubieren.
- Zeichnen Sie den OD600 mit einem Plattenlesegerät auf. Stellen Sie die Kontrollvertiefungen auf "leer" ein. Vergewissern Sie sich, dass das Kontrollmedium klar ist und keine Anzeichen von Trübung vorhanden sind. Wenn eine Trübung festgestellt wird, verwerfen Sie den Versuch. Die OD600-Werte können zur Normalisierung der Daten verwendet werden, wenn es signifikante Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämmen gibt.
- Entfernen Sie das Kulturmedium mit einer Vakuumleitung, indem Sie die Platte vorsichtig kippen und das Medium am unteren Rand der Vertiefung langsam ansaugen. Achten Sie darauf, das gesamte Kulturmedium zu sammeln, ohne die anhaftende Bakterienpopulation auf der Kunststoffoberfläche zu stören. Wenn während der Inkubationszeit eine extrazelluläre Polysaccharid (EPS)-Matrix gebildet wurde, wird die Matrix als weißer Niederschlag visualisiert. Stören Sie nicht die EPS-Matrix.
- Waschen Sie die Vertiefungen einmal vorsichtig mit 200 μl steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie die PBS-Wäsche mit der Vakuumleitung.
- Drehen Sie die Platte zum Trocknen um. Mindestens 20 Minuten trocknen lassen.
Anmerkung: Da der Biofilm vor der Färbung gründlich getrocknet werden muss, kann das Protokoll in diesem Schritt für einige Stunden oder sogar über Nacht pausiert werden. Die zusätzliche Trocknungszeit verändert das Färbeverfahren nicht, während eine unvollständige Trocknung die Quantifizierung der Ergebnisse und die Reproduzierbarkeit beeinträchtigt.
- Geben Sie 150 μl 0,5 % Kristallviolett in jede Versuchs- und Kontrollvertiefung.
- 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 400 μl destilliertem Wasser. Das zusätzliche Volumen hilft, restliche kristallviolette Flecken von den Seiten der Vertiefungen zu entfernen. Entfernen Sie die Wäsche mit der Vakuumleitung.
- Waschen Sie die Vertiefungen fünfmal mit 200 μl destilliertem Wasser. Entfernen Sie die Wäsche mit der Vakuumleitung.
Anmerkung: Gründliches Waschen ist wichtig für die Quantifizierung. Wenn die leeren Vertiefungen vom destillierten Wasser entfernt sind und keine Kristallviolettflecken enthalten, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
- Drehen Sie die Platte zum Trocknen um, um sie vor Licht zu schützen. Stellen Sie sicher, dass die Platte wie oben beschrieben vollständig getrocknet ist.
- Entfärben Sie die Vertiefungen mit 200 μl 95%igem Ethanol. Die Platte 30 min auf dem Shaker inkubieren lassen. Um Verdunstung zu vermeiden, insbesondere bei höheren Temperaturen, führen Sie diesen Schritt bei 4 °C durch.
- Zeichnen Sie mit einem Plattenleser die optische Dichte bei 540 (OD540) auf.
Anmerkung: Die Wellenlänge für die maximale Absorption von Kristallviolett liegt bei 590 nm. Die Literatur berichtet über einen Bereich von OD540 bisOD 595 für die Kristallviolett-Absorption; Wählen Sie daher eine Wellenlänge, die auf dem Plattenleser basiert.