>1. Vorbereitung von Reagenzien
- Gallensalze (BS) Medium: Zur Herstellung von tryptischer Sojabrühe (TSB) mit 0,4 % Gallensalzen (Gewicht/Volumen) resuspendieren Sie 200 mg Gallensalze in 50 ml autoklaviertem TSB. Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Wöchentlich frisch medium machen.
Notizen: Das routinemäßig verwendete Gallensalz ist ein 1:1-Gemisch aus Natriumcholat und Natriumdesoxycholat, das aus der Gallenblase von Schafen und Rindern isoliert wird. Wie bereits gezeigt, war das Vorhandensein von Glukose für die durch Gallensalz induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Verhältnis zur Luria-Bertani (LB)-Brühe hinzugefügt; und war daher ausreichend, um die Biofilmbildung in Shigella und den anderen analysierten enterischen Krankheitserregern zu induzieren. Abhängig von den zu analysierenden Bakterien können unterschiedliche Glukosekonzentrationen oder ein unterschiedlicher Zuckerbedarf erforderlich sein.
- 0,5 % w/v Kristallviolett in Wasser: Lösen Sie 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auf. Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren.
- Concanavalin A (ConA) konjugiert mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC): Rekonstituieren Sie den Stamm in 1x PBS. Verdünnen Sie das konzentrierte 10-mg-Material mit 400 μl 1x PBS auf eine Endkonzentration von 25 μg/ml und schützen Sie es vor Licht.
- PBS + Glukose: Lösen Sie 0,2 g Glukose in 10 mL 1x PBS (2% w/v Glukose endgültig). Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- PBS + Gallensalze: 40 mg in 10 mL 1x PBS auflösen (0,4% w/v Gallensalze endgültig). Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- PBS + Glukose und Gallensalze: Lösen Sie 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1x PBS (0,4 % w/v Gallensalze und 2 % w/v Glukose endgültig). Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- LB-Agarplatten vorbereiten.
- Formaldehyd/Glutaraldehyd-Fixierung: Geben Sie 810 μl Formaldehyd (37 % Stammlösung, 3 % Endkonzentration) und 125 μl Glutaraldehyd (25 % Stammlösung, 0,25 % Endkonzentration) zu 14 mL 1x PBS. Gründlich mischen und bei 4 °C lagern. Der Fix sollte für den ordnungsgemäßen Gebrauch kalt sein.
Vorsicht: Die Lösung ist giftig und erfordert die Entsorgung von Sondermüll.
- Eindecklösung: Verwenden Sie eine Eindecklösung, die 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Färbung enthält, um das Photobleichen von Immunfluoreszenzmikroskopieproben zu hemmen und gleichzeitig die DNA der Bakterien fluoreszierend zu färben.
>2. Vorbereitung von Bakterien
- Züchten Sie über Nacht Kulturen der zu testenden Bakterienstämme, indem Sie 3 ml TSB mit einer einzelnen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kulturröhrchen beimpfen. Inkubieren bei 37 °C mit Schütteln bei 225 U/min für die Inkubation über Nacht (16 - 24 h).
Anmerkung: Die Stämme sollten alle 2 bis 4 Wochen aus dem Gefrierschrank entnommen und auf Platten aufbewahrt werden, die nicht älter als 2 Wochen sind.
3. EPS Matrix-Erkennung
HINWEIS: Diese komplementären Assays quantifizieren und visualisieren den EPS. In beiden Fällen wird EPS mit einem Lektin nachgewiesen, um Polysaccharide zu binden. Das fluoreszierend konjugierte Protein ermöglicht eine Quantifizierung.
- Semiquantitativer Nachweis von EPS
- Stellen Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen auf. Etikettieren Sie mit TSB oder TSB + BS.
- Geben Sie 1 mL TSB oder TSB + BS in die jeweiligen Röhrchen.
- Die Röhrchen werden mit 20 μl Übernachtkultur (Verdünnung im Verhältnis 1:50) beimpft.
- Geben Sie in einer sterilen, schwarzen, mit Gewebekulturen behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden 130 μl/Well unbeimpftes Kontrollmedium in drei Wells, die als Blindkontrolle dienen. Richten Sie für jeden zu testenden Medientyp drei Kontrollvertiefungen ein. Geben Sie 130 μl/Vertiefung der inokulierten Kultur in die Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Versuchsbedingungen in dreifacher Ausfertigung plattiert sind.
- 4 - 24 h bei 37 °C statisch inkubieren.
- Übertragen Sie das Kulturmedium mit einer Pipette, idealerweise einer Mehrkanalpipette, auf eine durchsichtige 96-Well-Platte. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das gesamte Kulturmedium auffangen, ohne die anhaftende Population und/oder das EPS auf der Kunststoffoberfläche zu stören. Verwerfen.
- Fixieren Sie die schwarze Platte für 15 min bei RT mit 200 μl/Vertiefung Formaldehyd/Glutaraldehyd in 1x PBS.
- Während sich die adhärente Population fixiert, bewerten Sie die Überstandsfraktion aus Schritt 1.1.6. Zeichnen Sie den OD600 mit einem Plattenlesegerät auf. Stellen Sie die Kontrollvertiefungen auf "leer" ein. Vergewissern Sie sich, dass das Kontrollmedium klar ist und keine Anzeichen von Trübung vorhanden sind. Wenn eine Trübung festgestellt wird, verwerfen Sie den Versuch.
- Alternativ kann der gesamte Assay in einer schwarzen, durchsichtigen Bodenplatte durchgeführt werden. Unter diesen Umständen können die OD600-Werte aufgezeichnet und das Kulturmedium anschließend verworfen werden, bevor mit Schritt 3.1.7 fortgefahren wird. Die OD600-Werte können verwendet werden, um die Daten zu normalisieren, falls es signifikante Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen den Bakterienstämmen gibt.
- Entfernen Sie die Befestigung und entsorgen Sie sie im Sondermüll.
- Waschen Sie die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 200 μl/Vertiefung sterilem PBS. Entfernen Sie die PBS-Spülung mit der Vakuumleitung, indem Sie die Platte vorsichtig kippen und die Wäsche langsam am unteren Rand der Vertiefung ansaugen.
- Fügen Sie 150 μl/Vertiefung mit 25 μg/ml ConA-FITC hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei RT.
- Zweimal vorsichtig mit 200 μl PBS waschen.
- Geben Sie 150 μl PBS in jede Vertiefung. Zeichnen Sie die Fluoreszenz bei 488 nm auf.
