>1. Vorbereitung von Reagenzien
- Gallensalze Medium: Zur Herstellung von tryptischer Sojabrühe (TSB) mit 0,4 % Gallensalzen (Gewicht/Volumen) resuspendieren Sie 200 mg Gallensalze in 50 ml autoklaviertem TSB. Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Wöchentlich frisch medium machen.
Notizen: Das routinemäßig verwendete Gallensalz ist ein 1:1-Gemisch aus Natriumcholat und Natriumdesoxycholat, das aus der Gallenblase von Schafen und Rindern isoliert wird. Wie bereits gezeigt, war das Vorhandensein von Glukose für die durch Gallensalz induzierte Biofilmbildung erforderlich. TSB hat Glukose im Verhältnis zur Luria-Bertani (LB)-Brühe hinzugefügt; und war daher ausreichend, um die Biofilmbildung in Shigella und den anderen analysierten enterischen Krankheitserregern zu induzieren. Abhängig von den zu analysierenden Bakterien können unterschiedliche Glukosekonzentrationen oder ein unterschiedlicher Zuckerbedarf erforderlich sein.
- 0,5 % w/v Kristallviolett in Wasser: Lösen Sie 2,5 g Kristallviolett in 500 mL destilliertem Wasser auf. Der Filter sterilisiert mit einem 0,22 μm Filter.
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) + Glukose: Lösen Sie 0,2 g Glukose in 10 mL 1x PBS (2% w/v Glukose endgültig). Der Filter sterilisiert mit einem 0,22 μm Filter. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- PBS + Gallensalze: 40 mg in 10 mL 1x PBS auflösen (0,4% w/v Gallensalze endgültig). Filter mit einem 0,22 μm Filter sterilisieren. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- PBS + Glukose und Gallensalze: Lösen Sie 40 mg Gallensalze und 0,2 g Glukose in 10 mL 1x PBS (0,4 % w/v Gallensalze und 2 % w/v Glukose endgültig). Der Filter sterilisiert mit einem 0,22 μm Filter. Am Tag der Anwendung frisch machen.
- LB-Agarplatten vorbereiten.
>2. Vorbereitung von Bakterien
- Züchten Sie über Nacht Kulturen der zu testenden Bakterienstämme, indem Sie 3 ml TSB mit einer einzelnen, gut isolierten Kolonie in einem sterilen Kulturröhrchen beimpfen. Inkubieren bei 37 °C und Schütteln bei 225 U/min für die Inkubation über Nacht (16 - 24 h).
Anmerkung: Die Stämme sollten alle 2 bis 4 Wochen aus den Tiefkühlbeständen neu gestreift und auf Platten aufbewahrt werden, die nicht älter als 2 Wochen sind.
>3. Dispersions-Assay
HINWEIS: In diesem Assay wird der Abbau des Biofilms durch bakterielle Dispersion nachgewiesen. Hier werden reife Biofilme etabliert und anschließend (in der Regel am nächsten Tag) die Medien durch PBS ersetzt oder PBS ergänzt. Die überstehende Komponente wird dann bewertet, um die Anzahl der Bakterien zu quantifizieren, die sich vom Biofilm dissoziiert haben.
- Stellen Sie zwei 1,5-ml-Röhrchen auf. Etikettieren Sie mit TSB oder TSB + BS (Gallensalze).
- Geben Sie 1 mL TSB oder TSB + BS in die jeweiligen Röhrchen.
- Die Röhrchen werden mit 20 μl Übernachtkultur (in einer Verdünnung von 1:50) beimpft.
- Geben Sie in einer sterilen, durchsichtigen, mit Gewebekulturen behandelten 96-Well-Platte mit klarem Boden und flachem Boden 130 μl/Well unbeimpftes Kontrollmedium in drei Wells, die als Blindkontrolle dienen. Richten Sie für jeden zu testenden Medientyp drei Kontroll-Holes ein.
- Geben Sie 130 μl/Vertiefung der inokulierten Kultur in drei Vertiefungen und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Versuchsbedingungen in dreifacher Ausfertigung plattiert sind.
- Inkubieren Sie die Platte für 4 - 24 h bei 37 °C statisch.
- Bevor Sie fortfahren, erwärmen Sie PBS, PBS + Glukose, PBS + Gallensalze und PBS + Gallensalze + Glukose auf 37 °C. Bereiten Sie diese Reagenzien täglich frisch vor.
- Erfassen Sie mit einem Plattenleser die optische Dichte OD600. Stellen Sie die Kontrollvertiefungen auf "leer" ein. Vergewissern Sie sich, dass das Medium klar ist und keine Anzeichen von Trübung vorhanden sind. Wenn eine Trübung festgestellt wird, verwerfen Sie den Versuch. Die OD600-Werte können zur Normalisierung der Daten verwendet werden, wenn es signifikante Unterschiede in der Wachstumsrate zwischen Bakterienstämmen gibt.
- Entfernen Sie das Nährmedium mit einer Vakuumleitung. Achten Sie darauf, das gesamte Nährmedium zu sammeln, ohne die anhaftende Population auf der Kunststoffoberfläche zu stören.
- Waschen Sie die Vertiefungen zweimal vorsichtig mit 200 μl/Vertiefung sterilem PBS. Entfernen Sie die PBS-Wäsche mit der Vakuumleitung.
- Ersetzen Sie die Wäsche mit 130 μl/Vertiefung der folgenden Stoffe in jeweils drei Vertiefungen: PBS, PBS + Glukose, PBS + Gallensalze und PBS + Gallensalze + Glukose. Diese Reagenzien müssen auf 37 °C vorgewärmt werden.
- Die Platte 30 min bei 37 °C inkubieren.
- Nehmen Sie die Platte vorsichtig aus dem 37 °C heißen Inkubator. Übertragen Sie die Überstände auf eine frische, sterile 96-Well-Platte.
- Bereiten Sie mit einer 96-Well-Platte oder einem Verdünnungsblock 10-fache (1:10) Serienverdünnungen des Überstands zu sterilem PBS vor.
Anmerkung: Die Verdünnungsreihe sollte je nach zu testendem Bakterienstamm von unverdünnt bis 10-6 reichen. Es können Pilotversuche durchgeführt werden, um den optimalen Verdünnungsbereich zu bestimmen.
- 5 μl jeder Verdünnung mit einer Mehrkanalpipette auf den LB-Agar aufpolieren. Über Nacht bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie die Kolonien am nächsten Tag und berücksichtigen Sie den Verdünnungsfaktor bei der Bestimmung der wiederfindungskoloniebildenden Einheiten (KBE). Um die prozentuale Streuung relativ zur 1x PBS-Kontrolle (auf 100 % festgelegt) zu berechnen, dividieren Sie die Wiederfindungs-KBE aus jeder Behandlungsbedingung durch die Wiederfindungs-KBE aus der 1x PBS-Kontrollprobe.
Anmerkung: Routinemäßige Medienplatten für den interessierenden Bakterienstamm können ebenfalls verwendet werden. Shigella kann zum Beispiel auf roten Tellern aus dem Kongo plattiert werden. Stellen Sie sicher, dass die Platten trocken sind, um geeignete Spotbeschichtungstechniken zu ermöglichen.
