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>1. Herstellung eines in vitro Biofilms von Bakterien auf der Pilzkolonie
- Zentrifugieren Sie die Bakterienkultur bei 5.000 x g für 3 min und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (25 g/L KH2PO4 und 2,78 g/L K2HPO4, pH 5,8). Wiederholen Sie diesen Schritt einmal und stellen Sie die endgültige Bakterienkonzentration mit demselben Puffer auf 109 Zellen/ml ein.
- Füllen Sie eine 6-Well-Mikroplatte mit 5 ml der Bakteriensuspension (oder sterilem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer für die Negativkontrolle).
- Schneiden Sie die Zellophanmembran der Pilzkultur mit einer sterilen Rasierklinge ab, um Zellophanquadrate mit einer einzigen Pilzkolonie auf jeder Membran zu erhalten. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pinzette die Zellophanquadrate aus dem festen Medium und übertragen Sie das Zellophanquadrat mit den Hyphen in eine Vertiefung der Mikrotiterplatte, die die Bakteriensuspension enthält.
- Schütteln Sie die Mikroplatte vorsichtig, während die Pilzkolonien noch an der Zellophan haften. Entfernen Sie dann die Zellophanblätter, wobei Sie die Pilzkolonien in der Platte belassen.
- Inkubieren Sie die Mikroplatte unter leichtem Rühren (~60 U/min) bei einer Temperatur, die an die untersuchten Mikroorganismen angepasst ist.
Anmerkung: Die Inkubationszeit hängt von der Geschwindigkeit der Etablierung des Biofilms und dem zu analysierenden Stadium ab. Für P. fluorescens BBc6/L. bicolor 30 Minuten lang bei 20 °C inkubieren, um Biofilme im Frühstadium zu erhalten, und bis zu 16 Stunden, um reife Biofilme zu erhalten.
>2. Konfokalmikroskopische Laserscanning-Analyse der Biofilmbildung
- Probenvorbereitung
- Um planktonische Bakterien und Bakterien, die elektrostatisch an den Hyphen haften, zu entfernen, spülen Sie den Pilz ab, indem Sie ihn auf eine neue 6-Well-Mikroplatte umfüllen, die mit 5 ml einer starken Salzlösung (NaCl, 17 g/L) gefüllt ist; 1 Minute lang vorsichtig schütteln.
- Übertragen Sie den Pilz in eine neue 6-Well-Mikroplatte mit 5 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, schütteln Sie ihn 2 Minuten lang vorsichtig und übertragen Sie den Pilz in frischen Kaliumphosphatpuffer
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- Den Teil der abzubildenden Pilzkolonie wird mit einem Skalpell unter Beibehaltung des Kaliumphosphatpuffers so abgeschnitten, dass der erhaltene Schnitt etwa die Hälfte der Pilzkolonie enthält.
- Um die Probe zu färben, geben Sie sie in eine Petrischale, die mit sterilem Wasser gefüllt ist, das einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff enthält (je nach Ziel der Analyse), und inkubieren Sie sie im Dunkeln.
- Um das Pilznetzwerk zu visualisieren, verwenden Sie z. B. Congo Red (0,1 % Endkonzentration, 5 min Inkubation), Weizenkeim-Agglutin (WGA)-Lektin, konjugiert mit Alexa Fluor 633 (10 μg/ml Endkonzentration, 10 min Inkubation) oder FUN1 (10 μM Endkonzentration, 10 min Inkubation).
- Wenn Sie ein nicht fluoreszenzmarkiertes Bakterium verwenden, färben Sie die Bakterienzellen mit einer DNA-spezifischen Fluoreszenzsonde unter den zahlreichen im Handel erhältlichen zellpermeierten DNA-Farbstoffen. Verwenden Sie z. B. DAPI (0,25 μg/ml Endkonzentration, 10 min Inkubation).
- Um die Matrixproteine sichtbar zu machen, verwenden Sie eine Proteinfärbung.
- Spülen Sie die Probe nach dem Färben ab, indem Sie sie auf einen Petrischalendeckel mit 10 ml sterilem 0,1 M Kaliumphosphat geben und 1 Minute lang vorsichtig schütteln.
- Tauchen Sie einen Objektträger zur Hälfte in den Deckel der Petrischale und bringen Sie den geschnittenen Abschnitt vorsichtig dazu, über dem Objektträger zu schweben. Nehmen Sie dann den Objektträger langsam aus der Pufferlösung, so dass sich die Probe sanft auf dem Objektträger absetzen kann.
Anmerkung: Bei diesem Schritt ist es sehr wichtig, schonend vorzugehen, um eine Störung des Biofilms zu vermeiden.
- Zum Schluss wird die Probe mit 10 μl Antifading-Eindeckmedium befüllt und mit einem Glasdeckglas abgedeckt.
Anmerkung: Sobald der Objektträger vorbereitet ist, muss die mikroskopische Analyse so schnell wie möglich (innerhalb von maximal 30 Minuten) durchgeführt werden, um eine Veränderung der Biofilmstruktur zu vermeiden.