Echtzeit-Analyse der residenten T-Zell-Migration in verschiedenen Tumorregionen mittels konfokaler Mikroskopie

Zusammenfassung

Quelle: Peranzoni, Elisa, et al. Ex-vivo-Bildgebung von residenten CD8-T-Lymphozyten in menschlichen Lungentumorschnitten mittels konfokaler Mikroskopie. J. Vis. Exp. (2017).

Dieses Video beschreibt die Bildgebung von residenten tumorinfiltrierenden CD8-T-Zellen, die mit fluoreszenzgekoppelten Antikörpern in menschlichen Lungentumorschnitten markiert wurden. Diese Technik ermöglicht Echtzeitanalysen der Migration von CD8-T-Zellen mittels konfokaler Mikroskopie.

Protokoll

>1. Immunfärbung von residenten CD8-T-Zellen und Tumorzellen

1. Verdünnen Sie die Antikörper (Endkonzentration 10 μg/ml) und den Kernfarbstoff (Endkonzentration 1 μg/ml) in RPMI-1640-Medien ohne Phenolrot.
   Anmerkung: Verwenden Sie fluoreszenzgekoppelte Anti-CD8- (murines IgG, Klon SK1) und anti-EpCAM (Epithelzelladhäsionsmolekül) (murines IgG HEA-125) Antikörper, um CD8-T-Lymphozyten bzw. Tumorepithelzellen zu markieren. Verwenden Sie fluoreszenzgekoppelte Anti-CD90/Thy1-Antikörper (murines IgG, Klon 5E10), um Fibroblasten und aktivierte Endothelzellen zu markieren. Verwenden Sie 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um den Zellkern von Zellen mit einer geschwächten Plasmamembran zu markieren und so die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beurteilen.
2. Nehmen Sie die Kulturplatten aus dem Inkubator und saugen Sie mit einer Pipette die Flüssigkeit in den Edelstahlscheiben ab. Entfernen Sie nicht das 1,1-ml-RPMI-1640-Medium, das sich unter den Zellkultureinsätzen befindet.
3. Ohne die Scheibe zu berühren und mit einer Pipettenspitze 40 μl der Lösung mit den Antikörpern auf jede Tumorscheibe zu geben.
4. Inkubieren Sie die Platte 15 Minuten lang bei 37 °C, um eine Antikörperfärbung zu ermöglichen.
5. Entfernen Sie mit einer feinen Pinzette die Unterlegscheiben, nehmen Sie die Scheiben heraus und tauchen Sie sie 10 s in RPMI-1640-Medien ohne Phenolrot. Legen Sie die Scheiben wieder auf die Zellkultureinsätze und geben Sie einen Tropfen phenolrotfreies RPMI-1640-Medium auf jede einzelne Scheibe. Halten Sie die Platte 10 Minuten lang bei 37 °C. Fahren Sie mit der Bildgebung fort.

>2. Bildgebung und Analyse der Migration von residenten CD8-T-Zellen in menschlichen Lungentumorschnitten

HINWEIS: Das in diesem Protokoll verwendete konfokale Mikroskop ist eine aufrecht stehende rotierende Scheibe, die mit einem 25x Wasserimmersionsobjektiv (25x/0.95 N.A.) ausgestattet ist.

1. Vorbereitung des Mikroskopaufbaus
   1. Stellen Sie die Temperatur der Wärmekammer des Mikroskops einige Stunden vor Beginn der Bildgebung auf 37 °C ein.
   2. Richten Sie ein System ein, um Tumorschnitte ständig mit sauerstoffhaltigem (5 % CO₂, 95 % O₂) phenolrotfreiem RPMI-Medium zu perfundieren (Abbildung 1). Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um das Perfusionsmedium in die Bildgebungskammer zu leiten, und saugen Sie die Lösung in einen Abfallsammelkolben ab.
   3. Lassen Sie die Peristaltikpumpe laufen, damit die sauerstoffhaltige Lösung durch die Perfusionsschläuche gelangen kann.
2. Nehmen Sie die Scheibe mit einer feinen Pinzette aus der 6-Well-Platte und geben Sie sie in die 35-mm-Kunststoffschale, die mit phenolrotfreiem RPMI-Medium gefüllt ist. Fixieren Sie die Scheibe mit einem Scheibenanker mit einem Durchmesser von 19,7 mm und Gewinden im Abstand von 2 mm. Stellen Sie die Petrischale auf den bildgebenden Tisch des Mikroskops. Verbinden Sie die Ein- und Auslassspitzen des Perfusionssystems. Schalten Sie das Perfusionssystem ein und stellen Sie die Medienflussrate auf 0,8 ml/min ein.
3. Senken Sie das Wasserimmersionsobjektiv auf die Scheibe ab. Fokussieren Sie mit hellem Feldlicht auf den oberen Rand des Segments. Wählen Sie unter Verwendung von geeignetem Fluoreszenzlicht eine Region von Interesse aus, die CD8-T-Zellen, Tumorinseln (positiv für EpCAM) und einen Stromabereich (positiv für CD90) enthält. Überprüfen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Schnitte, indem Sie die DAPI-Färbung an der Schnittoberfläche und tiefer im Gewebe beurteilen.
   HINWEIS: Eine gesunde Scheibe enthält nur eine Minderheit von DAPI-positiven Zellen in mehreren Mikrometern Entfernung von der Schnittfläche.
4. Legen Sie eine Imaging-Sitzung mit den folgenden Aktionen fest.
   1. Abhängig von der Intensität des Fluoreszenzsignals der 3 Fluorophore stellen Sie die Belichtungszeit zwischen 50 und 800 ms und die Laserintensität zwischen 20 und 40 % ein.
   2. Wählen Sie die Dicke des Z-Stapels aus, die innerhalb des Tumor-Slices abgebildet werden soll.
      Anmerkung: Hier wurden 10-12 optische Ebenen mit einer Gesamttiefe von 60-70 μm in der z-Dimension erfasst.
   3. Wählen Sie die Startposition ca. 10 μm unterhalb der ersten markierten CD8-T-Zellen.
   4. Definieren Sie das Zeitintervall zwischen den einzelnen Z-Stapel-Bildern zwischen 10 und 30 s und die Gesamtaufnahmezeit zwischen 10 und 30 Minuten.

Ergebnisse

Abbildung 1: Fotografien des Perfusionssystems. A) Die phenolrotfreie RPMI-Lösung ist mit 5 % CO₂, 95 % O₂ angereichert. B) Die Lösung wird dann von einer Schlauchpumpe perfundiert. C) Die RPMI-Lösung gelangt über den Einlass in die Kulturschale. Am Auslass wird die Lösung von der Pumpe aus der Kammer in einen Abfallbehälter abgesaugt. Beachten Sie, dass die Aspirationsspitze...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aufrechtes konfokales Mikroskop	Leica	Die Verwendung einer konfokalen Spinning-Scheibe wird empfohlen
Imaris Software	Bitplane		Diese Software wird zur Visualisierung von Bildern und zur Verfolgung der T-Zell-Migration verwendet
Feine Pinzette	Welt Präzisionsinstrumente	Artikel-Nr.: 14142
30 mm Kultureinsätze	Millipore	PICM0RG50
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) mittel, GlutaMAX Ergänzung	ThermoFisher	61870010	Das komplette RPMI-Medium wird durch Zugabe von 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum und Penicillin/Streptomycin hergestellt
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	ThermoFisher	20012019
Hanks' ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Invitrogen	14170088
Niedrige Geliertemperatur Agarose, Typ VII-A	Sigma-Aldrich	Nr. A0701
Ungiftiger Butylcyanacrylat-Kleber, Vetbond	3M	Nr. 1469
Scheibenanker, Durchmesser 19,7, Gewindeabstand 2 mm	Warner Instruments	Nr. 64-1415
Unterlegscheiben aus Edelstahl, Innendurchmesser 5 mm	Amazonas	B004K1FDGQ
BV605-konjugiertes Anti-CD8 (Klon SK1)	BD Biowissenschaften	565289
FITC-konjugiertes Anti-EpCAM (Klon HEA-125)	Miltenyi Biotec	Tel.: 130-098-113
BV510-konjugiertes Anti-CD90 (Klon 5E10)	Biolegende	328125
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI	ThermoFisher	Nr. D1306