HINWEIS: Dieses Protokoll betont die Verwendung der FRET-Durchflusszytometrie zum Nachweis der Seeding-Aktivität aus biologischen Mausproben. Es ist auch kompatibel mit rekombinanten Fibrillen und humanbiologischen Proben. Die Euthanasie von Mäusen und die Entnahme von Gehirnen wurden in Übereinstimmung mit den von der IACUC zugelassenen Verfahren durchgeführt.
>1. Extraktion des Gehirns
- Nach tiefer Anästhesie mit Isofluran (2%) wurde eine Maus mit eiskaltem PBS mit 0,03% Heparin perfundiert und das Gehirn gemäß den in Gage et al. beschriebenen Details extrahiert.
- Geben Sie das extrahierte Gewebe in ein Kryo-Fläschchen und frieren Sie es ein, indem Sie es in flüssigen Stickstoff geben. Alternativ können Sie das Taschentuch auf Trockeneis einfrieren. Nach dem Einfrieren das Gewebe auf -80 °C erhitzen und bei Bedarf über einen längeren Zeitraum lagern.
Anmerkung: Dieses Protokoll ist kompatibel mit Ganzhirnhomogenaten oder mikropräparierten Hirnregionen. Siehe Hagihara et al.für ein detailliertes Mikrodissektionsprotokoll.
>2. Aufbereitung von biologischem Saatgut
- Homogenisierungspuffer herstellen, indem Proteaseinhibitoren (Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) frei) in 1x TBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung, 1 Tablette pro 10 ml) aufgelöst werden. Kräftig vortexen und auf Eis lagern. Proteaseinhibitoren müssen EDTA-frei sein, um die Lebensfähigkeit der Biosensorzellen zu erhalten.
- Wiegen Sie gefrorenes Hirngewebe in einem Einweg-Waagschiffchen und geben Sie es in ein konisches 5-ml-Röhrchen. Fügen Sie eiskalten Homogenisierungspuffer hinzu, so dass die endgültige Lösung 10 % Gew./Volumen beträgt. Vorübergehend auf Eis lagern. Die Gewebemasse und das anschließende Volumen des Homogenisierungspuffers variieren je nach Gehirngröße und/oder verwendeten Regionen. Hier wird ein adultes Maus-Halbhirn mit einem Gewicht von 0,2 g in 2 ml für eine 10%ige w/vol-Lösung suspendiert.
- Übertragen Sie die Proben in einen Kühlraum und stellen Sie einen Sonden-Ultraschallator auf die entsprechenden Einstellungen ein. Für die Sondenbeschallung mit einem Omni Ruptor (hier abgebildet) stellen Sie die Leistung auf 20 % ein, was ca. 75 W entspricht. Verwenden Sie einen Impulsmodus, um sicherzustellen, dass die Proben während der Beschallung nicht überhitzt werden. Stellen Sie den Impulsgeber auf 30 % ein, was ca. 500 ms entspricht.
- Reinigen Sie die Spitze des Sonden-Ultraschallgeräts, indem Sie es mit Wasser, Isopropanol und erneut Wasser abspülen und die Sonde zwischen jeder Lösung abwischen. Achten Sie darauf, sowohl die Seiten als auch die Unterseite der Sonde mit Labortüchern abzuspülen und abzuwischen.
- Arbeiten Sie mit jeweils einer Probe, tauchen Sie die Sondenspitze in den Homogenisierungspuffer und starten Sie den Ultraschallgerät. Geben Sie mit den oben beschriebenen Leistungs- und Impulsgebereinstellungen insgesamt 25 Impulse ab. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig in Suspension ist. Achten Sie darauf, dass die Probe während dieses Schritts nicht schäumt.
Anmerkung: Proben sind anfällig für Schaumbildung, wenn a) das Gesamtvolumen gering ist oder b) sich das Homogenat erwärmt. Mit diesem speziellen Gerät dürfen Sie nicht mit Volumina von weniger als 250 μl beschallen. Um sicherzustellen, dass die Proben gekühlt bleiben, können die Röhrchen während dieses Schritts auf Eis gelagert werden.
- Reinigen Sie die Sonde, indem Sie das restliche Lysat abwischen, und geben Sie dann 10 Impulse in ein Becherglas mit sauberem Wasser. Spülen Sie die Seiten und den Boden der Sonde mit Wasser, Isopropanol und erneut Wasser ab (wie in Schritt 2.4) und wischen Sie sie zwischen den einzelnen Schritten trocken. Um eine Kontamination zu vermeiden, spülen Sie die Sonde zwischen den Proben gründlich aus.
Anmerkung: Bei Tau-Aggregaten haben wir nicht festgestellt, dass strengere Reinigungsmethoden erforderlich sind, um eine Kontamination von Probe zu Probe zu verhindern. Andere Amyloide können jedoch zusätzliche Pflege erfordern, die in der Literatur ausführlich beschrieben wurde.
- Lagern Sie die Homogenate auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind.
- Schleudern homogenisiert bei 21.300 x g für 15 min bei 4 °C.
- Den Überstand in ein sauberes Rohr umfüllen und dabei darauf achten, das Pellet nicht zu stören. Entsorgen Sie das Pellet. Aliquotieren Sie den Überstand und lagern Sie die Lysate zur weiteren Verwendung bei -80 °C. Vermeiden Sie jedoch Gefrier-/Auftauzyklen der Homogenate, da dies die Effizienz der Aussaat verringert.
>3. Beschichtung von Biosensorzellen
HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Assay vier Zelllinien: HEK 293T (Zelllinie #1), RD-P301S-CFP (Zelllinie #2), RD-P301S-YFP (Zelllinie #3) und RD-P301S-CFP/YFP (Zelllinie #4). In der Referenztabelle 1 finden Sie den Beitrag der einzelnen Zelllinien zum Assay.
- In einer sterilen Umgebung ist das Kulturmedium zu aspirieren. Spülen Sie die Zellen mit warmer phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und aspirieren Sie. Trypsinisieren Sie die Zellen (3 ml Trypsin-EDTA (0,05 %)) für 3 Minuten, schrecken Sie sie mit warmem Kulturmedium (9 ml DMEM, 10 % fötales Rinderserum (FBS), 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % GlutaMax ab und überführen Sie die Zellen sofort in ein konisches Röhrchen.
- Zellen bei 1.000 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Medium aspirieren und Zellpellets in warmem Kulturmedium resuspendieren.
- Bestimmen Sie mit einem Hämozytometer die Zelldichte für jede Zelllinie. Die Zelldichte variiert je nach Konfluenz zum Zeitpunkt der Ernte und dem Resuspensionsvolumen. Resuspendieren Sie Zellen, die aus einer 10-cm-Schale bei 90 % Konfluenz in 10-ml-Medien entnommen wurden, für eine Zelldichte von ca. 1 Million Zellen/ml.
- Erstellen Sie einen Mastermix aus Zellen + Medien so, dass jede Vertiefung einer 96-Well-Platte 35.000 Zellen in 130-μl-Medien enthält (z. B. um einen Mastermix für 100 Wells herzustellen, resuspendieren Sie 3,5 Millionen Zellen in 13-ml-Medien). Ändern Sie die Zellennummer, um sie an individuelle Versuchspläne und Zeitpläne anzupassen. Für die Zellbehandlung ~18 Stunden nach dem Plattieren fügen Sie 35.000 Zellen in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu.
- Pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette langsam 130 μl Mastermix-Zellsuspension in jede Vertiefung einer mit Gewebekulturen behandelten 96-Well-Platte mit flachem Boden. Platzieren Sie die Pipettenspitze während des Plattierens in der Mitte der Vertiefung und berühren Sie nicht den Boden der Platte.
Anmerkung: Obwohl das Beschichtungsformat geändert werden kann, wird empfohlen, n = 4 Wells für jede der Zelllinien 1-3 pro Platte herzustellen. Der Rest der Platte (n = 84) ist für die Zelllinie #4 (Biosensorzellen) reserviert.
- Lassen Sie die Zellen ruhen, indem Sie die Platte 10 Minuten lang bei RT ungestört lassen. Inkubieren Sie O/N bei 37 °C, 5 % CO2 und ≥80 % relativer Luftfeuchtigkeit.
>4. Zellen behandeln
HINWEIS: Am nächsten Tag, wenn Tau-Biosensorzellen zu 60-65% konfluent sind, bereiten Sie Samentransduktionskomplexe wie folgt vor:
- Kombinieren Sie in einem Röhrchen ein Transfektionsreagenz, wie z. B. Lipofectamine, mit einem reduzierten Serummedium, wie z. B. Opti-MEM, um einen Mastermix herzustellen. Pro Vertiefung 1,25 μl Transfektionsreagenz und 8,75 μl Medium mit reduziertem Serum hinzufügen. Das Röhrchen zum Mischen vorsichtig schnippen, kurz herunterschleudern und 5 Minuten bei RT inkubieren.
- In einem anderen Röhrchen wird das Samenmaterial (aliquot des Lysats aus Schritt 2.9) mit einem Medium mit reduziertem Serum kombiniert
Anmerkung: Das Volumen des Saatguts variiert je nach individuellem Versuch. Bei der Auswahl des Saatgutvolumens ist Folgendes zu berücksichtigen: die Menge an Saatgut in einer Probe und die potenzielle Toxizität. Rohe Homogenate können für Zellen giftig sein. Verwenden Sie daher die geringstmögliche Lautstärke, um den gewünschten Effekt zu überwachen. Zuvor getestete Volumina von Lysat/Vertiefung reichen von 1-5 μl, was 5-20 μg Gesamtprotein entspricht. Stellen Sie sicher, dass das Gesamtvolumen pro Vertiefung (Seeds + Medium mit reduziertem Serum) 10 μl beträgt.
- Kombinieren Sie den Inhalt aus den beiden in 4.1 und 4.2 beschriebenen Röhrchen, schnippen Sie zum Mischen leicht, schleudern Sie kurz herunter (1.000 x g, 5 Sekunden) und inkubieren Sie mindestens 20 Minuten und bis zu 2 Stunden bei RT.
- Pipettieren Sie vorsichtig 20 μl Transduktionskomplex an der Seite der einzelnen Biosensor-Wells. Verwenden Sie, wenn möglich, drei technische Replikate. Bringen Sie die behandelten Zellen für 24-48 Stunden in den Inkubator zurück. Inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt 3.6.
beschrieben
Anmerkung: Die geeignete Negativkontrollbedingung für diesen Aufbau sind Biosensorzellen, die mit leeren Liposomen (d. h. Liposomenreagenz + reduziertes Serummedium) behandelt wurden, da die Anwendung von Phospholipiden eine leichte Verschiebung des Fluoreszenzprofils im Vergleich zu Biosensorzellen einführt, die keinem Liposomenreagenz ausgesetzt sind.
>5. Entnahme von Zellen für die FRET-Durchflusszytometrie
HINWEIS: Vor der Zellernte – in der Regel 24-48 Stunden nach der Behandlung – ist es möglich, eine vorläufige Ablesung der Aussaataktivität mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) Filter an einem standardmäßigen inversen Fluoreszenzmikroskop zu erhalten. Zellen, die ohne Samenmaterial (d. h. leere Liposomen) behandelt wurden, zeigen eine diffuse Fluoreszenz, während Zellen, die mit Samenmaterial behandelt wurden, intensive punktförmige und retikuläre intrazelluläre Einschlüsse aufweisen (Abbildung 1A-B).
- Mit einer Mehrkanalpipette wird das gesamte Zellmedium (150 μl) aspiriert. Trypsinisieren Sie die Zellen (50 μl) für 5 min und schrecken Sie sie mit 150 μl gekühltem Kulturmedium ab. Nehmen Sie in diesem Schritt keine PBS-Spülung vor der Trypsinisierung auf, da dies zu Zelllifting und anschließendem Zellverlust führen kann. Schließen Sie kontaminierende tote Zellen und Ablagerungen während der Durchflusszytometrie durch Gating-Strategien aus.
- Unmittelbar nach dem Abschrecken werden die Zellen auf eine runde 96-Well-Bodenplatte umgefüllt und 5 Minuten lang bei RT bei 1.000 x g zentrifugiert.
- Das Medium aspirieren und entsorgen, wobei darauf zu achten ist, dass das Zellpellet nicht gestört wird.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, aber gründlich in 50 μl 2 % Paraformaldehyd und inkubieren Sie es 10 Minuten lang. Alternativ können Sie die Zellen lebend laufen lassen, obwohl die Fixierung sauberere und konsistentere Ergebnisse liefert.
- Zellen bei 1.000 x g für 5 min bei RT zentrifugieren. Paraformaldehyd aspirieren und verwerfen, dabei darauf achten, dass das Zellpellet nicht gestört wird.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, aber gründlich in 200 μl gekühltem Durchflusszytometrie-Puffer (Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), 1 % FBS, 1 mM EDTA) und lassen Sie die Platte so schnell wie möglich laufen, um ein Verklumpen der Zellen zu vermeiden.
>6. FRET-Durchflusszytometrie
HINWEIS: Verwenden Sie ein Durchflusszytometer wie das MACSQuant VYB, das mit FRET-kompatiblen Laserlinien und Filtersets ausgestattet ist (Tabelle 2). Klicken Sie für jeden Schritt in diesem Abschnitt mit der 96-Well-Vorlage der Software auf die gewünschte Vertiefung und klicken Sie auf "Wiedergabe", um die Probenaufnahme und den Probenfluss zu starten. Erstellen Sie Diagramme oder Statistiktabellen, indem Sie auf das Symbol "Neues Analysefenster" klicken. Ändern Sie die Achsenparameter in einzelnen bivariaten Diagrammen, indem Sie auf den Titel auf der X- oder Y-Achse klicken und den entsprechenden Filter auswählen. Um Zellpopulationen oder Fluoreszenzsignale zu verschieben, erhöhen oder verringern Sie die Spannungen, die mit den entsprechenden Filtern verbunden sind. Mit diesem Gerät können Sie <1.000 Ereignisse/s ausführen, um eine genaue Einzelzellüberwachung zu gewährleisten.
- Erstellen Sie ein bivariates Diagramm zwischen Side Scatter-Area (SSC-A) und Forward Scatter-Area (FSC-A) und passen Sie bei laufender Zelllinie #1 die SSC- und FSC-Spannungen an, bis sich die Zellpopulation im unteren linken Quadranten befindet. Klicken Sie auf das Polygonwerkzeug, und definieren Sie die Zellauffüllung (Gate P1). Alle Gating-Parameter finden Sie in Abbildung 2.
- Erstellen Sie ein bivariates Diagramm von FSC-H (Höhe) vs. FSC-A und wenden Sie Gate P1 auf dieses Diagramm an, indem Sie über dem Diagramm auf "live" klicken und P1 auswählen. Wenn die Zelllinie #1 ausgeführt ist, klicken Sie auf das Polygonwerkzeug, und definieren Sie einzelne Zellen (Gate P2).
- Erstellen Sie 3 Histogrammdiagramme, eines für jeden der interessierenden Filter: CFP, YFP und FRET. Wenden Sie Gate P2 auf alle diese Plots an, indem Sie über den Plots auf "live" klicken und P2 auswählen. Wenn Zelllinie #1 läuft, passen Sie die Spannungen so an, dass die mediane Zellpopulation in den CFP-, YFP- und FRET-Histogrammen alle zwischen 0 und 1 liegt. Um CFP und FRET zu messen, regen Sie Zellen mit dem 405-nm-Laser an und erfassen Sie die Fluoreszenz mit einem 450/50-nm- bzw. 525/50-nm-Filter. Um YFP zu messen, regen Sie Zellen mit einem 488-nm-Laser an und fangen Sie Fluoreszenz mit einem 525/50-nm-Filter ein. Die Laser- und Filtereinstellungen werden in Tabelle 2 näher beschrieben.
- Kompensation für CFP-Spillover in die FRET- und YFP-Kanäle durchführen.
Anmerkung: Die Kompensation ist der Prozess der Fluoreszenz-Spillover-Korrektur. Ein Fluoreszenz-Spillover tritt immer dann auf, wenn die Fluoreszenzemission eines Fluorochroms in einem Filter nachgewiesen wird, der zur Messung des Signals eines anderen Fluorochroms ausgelegt ist. Bei richtiger Kompensation kann die CFP-Spillover-Fluoreszenz aus den FRET- und YFP-Kanälen entfernt werden.
Anmerkung: Die Kompensation erfordert das Vorhandensein von sowohl fluoreszenzpositiven als auch -negativen Zellen. Um CFP-positive Zellen (Zelllinie #2) zu kompensieren, müssen daher negative Zellen (Zelllinie #1) vor dem Lauf zur Probe hinzugefügt werden.
- Spike in 30 μl Zelllinie #1 Suspension aus einem einzelnen Well in 200 μl Zelllinie #2 Suspension unmittelbar vor der Kompensation.
- Klicken Sie auf das Symbol "Geräteeinstellungen", dann auf die Registerkarte "Kompensation" und aktivieren Sie "Matrix", um die Kompensationstabelle zu öffnen.
- Erstellen Sie ein bivariates FRET-A- vs. CFP-A-Diagramm und wenden Sie das Gate P2 an, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Wenn die Zelllinien 1+2 ausgeführt sind, klicken Sie auf das Quadrantensymbol und zeichnen Sie die Quadranten so, dass die Fluoreszenz-negativen und -positiven Populationen durch die unteren beiden Quadranten (Gates LL3 bzw. LR3) getrennt sind.
- Erstellen Sie eine Statistiktabelle, in der die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) von FRET für die LL3- und LR3-Gatter angezeigt wird. Passen Sie den FRET-Parameter in der Kompensationsmatrix an, bis der MFI des FRET-Signals zwischen LL3 und LR3 entspricht. Nach diesem Schritt ist der MFI des FRET-Signals zwischen ungefärbten Zellen und CFP-positiven Zellen gleich, was darauf hindeutet, dass kein CFP-Spillover in den FRET-Kanal vorhanden ist.
- Erstellen Sie ein bivariates Diagramm YFP-A vs. CFP-A und wenden Sie das Gate P2 an, wie in Schritt 6.3 beschrieben. Zeichnen Sie die Quadranten (LL4 und LR4) ähnlich wie in Schritt 6.4.3.
- Erstellen Sie eine Statistiktabelle, in der der MFI des YFP für LL4 und LR4 angezeigt wird. Passen Sie den YFP-Parameter in der Kompensationsmatrix an, bis der MFI des YFP-Signals äquivalent zwischen LL4 und LR4 ist. Nach diesem Schritt ist der MFI eines YFP-Signals zwischen ungefärbten Zellen und CFP-positiven Zellen gleich, was darauf hindeutet, dass kein CFP-Spillover in den YFP-Kanal vorhanden ist.
- Markieren Sie nach dem Einrichten und Korrigieren des Schiebers interessante Bohrlöcher und führen Sie den Rest der Platte durch.
- Nachdem alle Beispiele ausgeführt wurden, exportieren Sie die Datendateien, indem Sie auf "Datei" und dann auf "Kopieren" klicken. Wählen Sie die Registerkarte "Datendateien" aus, markieren Sie den Experimentordner und klicken Sie auf "Kopieren".
