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Eine Technik zur Bewertung der inhibitorischen Wirkung der Toxinexposition auf miniaturisierte exzitatorische postsynaptische Ströme (mEPSCs)

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Quelle: Hubbard, K. et. al., Funktionelle Bewertung biologischer Neurotoxine in vernetzten Kulturen von Stammzell-abgeleiteten Neuronen des Zentralnervensystems.J. Vis. Exp. (2015)

Das Video zeigt die elektrophysiologische Analyse von embryonalen Stammzellen-abgeleiteten Neuronen nach Exposition gegenüber Neurotoxinen. Die Behandlung dieser Neuronen mit Botulinum-Neurotoxinen reduziert die Häufigkeit spontaner erregender Miniaturströme nach synaptischer Ströme, was die Hemmung der synaptischen Übertragung bestätigt.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

>1. Anpassung von embryonalen Stammzellen (ESCs) an Feeder-Zell-freie Suspensionskultur

  1. Die ESCs bei 37 °C auftauen, bis ein Eissplitter übrig bleibt.
  2. Mit einer P1000-Pipette 1 - 2,5 x 106 dissoziierte ESCs vorsichtig in eine nicht mit Gewebekulturen behandelte Schale mit 10 ml vorgewärmtem ESC-Medium übertragen. In einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator 20 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO2) inkubieren.
  3. Nach 20 Stunden werden die Zellen gewaschen, indem die Suspensionskultur mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt wird. Pellet ESCs für ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Abbildung 1. Suspensionsangepasste ESNs bleiben mitotisch stabil und exprimieren Marker für Pluripotenz.(A) Schema der ESC-Wartung und -Differenzierung. Das Vorhandensein oder Fehlen von Retinsäure (RA) oder Leukämie-Hemmfaktor (LIF) wird mit einem + oder – gekennzeichnet. Es wird ein Vergleich zwischen Tagen in vitro (DIV) und klassischen Entwicklungsstadien (DS) für pri.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tabelle 1. ESC und ESN
Knockout-DMEMLebenstechnologienTel.: 10829-018Medium: ESC-Nährmedium
      Formulierung und Hinweise: 500 mL
100x MEM NEAALebenstechnologienTel.: 11140-050Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
      Rezeptur und Anmerkungen: 6 mL
200 mM L-Alanyl-L-GlutaminATCCNr. 30-21156 mL
ES-qualifiziertes FBSVerwendete StammzellenASM-500790 mL
100x AntibiotikaSigma-AldrichNr. A59553 mL
55 mM 2-MercaptoethanolLebenstechnologienArtikel-Nr.: 21985-0231,1 mL
107 Einheiten/ml LIFMilliporeESG110760 μL
Knockout-DMEMLebenstechnologienTel.: 10829-018Medium: ESC-Differenzierungsmedium
      Formulierung und Anmerkungen: 436,6 mL
100x MEM NEAALebenstechnologienTel.: 11140-050Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
      Formulierung und Anmerkungen: 5 mL
200 mM L-Alanyl-L-GlutaminATCCNr. 30-21155 mL
ESC-qualifiziertes SerumVerwendete StammzellenASM-500750 mL
100x AntibiotikaSigma-AldrichNr. A59552,5 mL
55 mM 2-MercaptoethanolLebenstechnologienArtikel-Nr.: 21985-0230,9 mL
Dulbecco's PBSSigma-AldrichNr. D8537Medium: NPC-Trypsinisierungsmedium
      Formulierung und Hinweise: 100 mL
0,5 M EDTA (18,3 %)Sigma-Aldrich3690Medium: Einfrieren in 5 mL Aliquote
       Rezeptur und Anmerkungen: 0,266 mL
TrypsinSigma-AldrichNr. T880250 mg
Polyethylenimin (PEI)Sigma-AldrichNr. P3143Medien: Lösungen für die Oberflächenbeschichtung
      Formulierung und Hinweise: 2,5 μg/mL in H20
Poly-D-Lysin (PDL)Sigma-AldrichNr. 7280Medium: innerhalb von 1 Woche verbrauchen
      Formulierung und Hinweise: 100 μg/mL in H20
LamininSigma-AldrichNr. L20205 μg/mL in H20
DMEM/F12 + GlutaMAXLebenstechnologienArtikel-Nr.: 10565-018Medien: NPC-Kulturmedium
      Rezeptur und Anmerkungen: 492,5 mL
100x N2 VitamineLebenstechnologienArtikel-Nr.: 17502-048Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
      Formulierung und Anmerkungen: 5 mL
100x AntibiotikaSigma-AldrichNr. A59552,5 mL
Neurobasal ALebenstechnologienTel.: 10888-022Medien: ESN-Kulturmedium
      Formulierung und Anmerkungen: 482,5 mL
50x B27 VitamineLebenstechnologienArtikel-Nr.: 17504-044Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
      Formulierung und Hinweise: 10 mL
200 mM L-Alanyl-L-GlutaminATCCNr. 30-21155 mL
100x AntibiotikaSigma-AldrichNr. A59552,5 mL
5-Fluor-2'-Desoxyuridin (5FDU)Sigma-AldrichNr. F0503Medien: 2000x Mitotische Inhibitoren aliquotieren und bei -20 °C lagern
      Formulierung und Anmerkungen: dd 150 mg 5FDU und 350 mg Uridin auf 10 mL Neurobasal A. Sterilfilter, aliquot und einfrieren. Verwenden Sie das 2000-fache im ESN-Kulturmedium.
UridinSigma-AldrichU3003
TrypLE Express TrypsinLebenstechnologienArtikel-Nr.: 12605-010Medien: Sonstiges
      Rezeptur und Notizen: bei RT lagern
DmsoSigma-AldrichNr. D8418Shop bei RT
Sojabohnen-Trypsin-Hemmer (STI)Sigma-AldrichNr. T6414bei -20 °C lagern
EthanolSigma-AldrichNr. E7023Shop bei RT
AscorbinsäureSigma-AldrichNr. A4403Bereiten Sie 100 mM Brühe vor, indem Sie 100 mg Ascorbinsäure in 5,7 ml 50:50 DMSO/Ethanol-Mischung auflösen.
Retinsäure (RA)Sigma-AldrichNr. R2625Resuspendieren Sie 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/Ethanol. Ergänzen Sie mit 1 mL 100 mM Ascorbinsäurebrühe. Aliquot und bei -80 °C gelagert. Stabil für 6 Monate.
Tabelle 2. Nebel
NaClSigma-AldrichArtikel-Nr.: 71386Medium: Extrazellulärer Aufnahmepuffer
      Endkonzentration (mM): 58,44
      MW: 140
KclSigma-AldrichArtikel-Nr.: 60135Medien: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
      Endkonzentration (mM): 74,56
      MW: 3,5
NaH2PO4Sigma-AldrichNr. S3139Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
      Endkonzentration (mM): 119,98
      MW: 1,25
CaCl2Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 21115Endkonzentration (mM): 110,98
      MW: 2
MgCl2Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 63069Endkonzentration (mM): 95,21
      MW: 1
D-GlukoseSigma-AldrichNr. G8644Endkonzentration (mM): 180,16
      MW: 10
HEPESSigma-AldrichNr. H0887Endkonzentration (mM): 238,3
      MW: 10
K-GluconatSigma-AldrichNr. P1847Medium: Intrazellulärer Aufzeichnungspuffer
      Endkonzentration (mM): 234,5
      MW: 140
NaClSigma-AldrichArtikel-Nr.: 71386Medien: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
      Endkonzentration (mM): 58,44
      MW: 5
Mg-ATPSigma-AldrichNr. A9187Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
      Endkonzentration (mM): 507,18
      MW: 2
Li-GTPSigma-AldrichNr. G5884Endkonzentration (mM): 523,18
      MW: 0,5
CaCl2Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 21115Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
      Endkonzentration (mM): 110,98
      MW: 0,1
MgCl2Sigma-AldrichArtikel-Nr.: 63069Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
      Endkonzentration (mM): 95,21
      MW: 1
EGTA (EGTA)Sigma-AldrichNr. E3889380.35
Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 mo.
Endkonzentration (mM): 380,35
MW: 1
HEPESSigma-AldrichNr. H0887Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
      Endkonzentration (mM): 238,3
      MW: 10
BicucullineTocrisNr. 131Medien: Sonstiges
      Endkonzentration (mM): 0,01
      MW: 417,85
CNQXSigma-AldrichNr. C239Endkonzentration (mM): 0,01
      MW: 276,12
TetrodotoxinSigma-AldrichNr. A8001Endkonzentration (mM): 0,005
      MW: 645,74
BoNT/A-/GMetabiologikaN/AMedien:
      Endkonzentration (mM): TBD
      MW: 150.000
TetanustoxinSigma-AldrichNr. T3194Endkonzentration (mM): TBD
      MW: 150.000
SigmacoteSigma-AldrichSL-2Endkonzentration (mM): N/A
       MW: N/A
Tabelle 3. Ausrüstung und Software
MiniAnalysis (Version 6.0.7)Synaptosoft, Inc.N/ASoftware zur Ereigniserkennung
Igor Pro (Version 6.22A)WaveMetrics (Englisch)N/ASoftware zur Visualisierung von Aufnahmen
PatchmasterHekaN/ASoftware zur Datenerfassung
Olympus IX51 inverses MikroskopOlympN/A
MikromanipulatorSutter-InstrumentMPC-365
Patch-Clamp-VerstärkerHekaECB10USB
Abzieher für MikropipettenSutter-InstrumentP-1000
Kapillarrohre aus BorosilikatglasSutter-InstrumentArtikel-Nr.: B150-86-10Corning 7740
18 mm Deckgläser aus GlasFischerTel.: 12-545-84
Plasma-ReinigerHarrick PlasmaPDC-32G
Zellsieb (40 μm)FischerTel.: 08-771-1
Stovall Bauchtänzerin ShakerFischerTel.: 15-453-211
Schalen mit geringer AdhäsionFischerTel.: 05-539-101Corning 3262
BakteriengerichteVWRTel.: 25384-302100 x 15 mm
kg

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Miniature Excitatory Postsynaptic CurrentsBotulinum Neurotoxin ExposureElectrophysiological AnalysisStem Cell derived NeuronsNeurotransmitter Release InhibitionGigaseal FormationVoltage clamp RecordingTetrodotoxin ApplicationBicuculline AntagonismmEPSC Frequency Measurement

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