Eine Technik zur Bewertung der inhibitorischen Wirkung der Toxinexposition auf miniaturisierte exzitatorische postsynaptische Ströme (mEPSCs)

Zusammenfassung

Quelle: Hubbard, K. et. al., Funktionelle Bewertung biologischer Neurotoxine in vernetzten Kulturen von Stammzell-abgeleiteten Neuronen des Zentralnervensystems.J. Vis. Exp. (2015)

Das Video zeigt die elektrophysiologische Analyse von embryonalen Stammzellen-abgeleiteten Neuronen nach Exposition gegenüber Neurotoxinen. Die Behandlung dieser Neuronen mit Botulinum-Neurotoxinen reduziert die Häufigkeit spontaner erregender Miniaturströme nach synaptischer Ströme, was die Hemmung der synaptischen Übertragung bestätigt.

Protokoll

>1. Anpassung von embryonalen Stammzellen (ESCs) an Feeder-Zell-freie Suspensionskultur

1. Die ESCs bei 37 °C auftauen, bis ein Eissplitter übrig bleibt.
2. Mit einer P1000-Pipette 1 - 2,5 x 10⁶ dissoziierte ESCs vorsichtig in eine nicht mit Gewebekulturen behandelte Schale mit 10 ml vorgewärmtem ESC-Medium übertragen. In einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator 20 Stunden bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO₂) inkubieren.
3. Nach 20 Stunden werden die Zellen gewaschen, indem die Suspensionskultur mit einer serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig in ein konisches 15-ml-Röhrchen überführt wird. Pellet ESCs für 3 min bei 200 x g. Während des Schleuderns 10 ml frische ESC-Schale mit mittlerer bis geringer Haftung hinzufügen.
4. Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, dass sich das Zellpellet nicht löst, und fügen Sie dem Zellpellet 1 ml frisches ESC-Medium hinzu. Übertragen Sie die Zellen mit einer P1000-Pipette in die Bakterienschale und kehren Sie in den Inkubator zurück.
5. Beobachten Sie die Zellen täglich, bis die Aggregate mit bloßem Auge sichtbar werden (typischerweise 4 - 8 Tage (d); die Aggregate betragen 0,2 - 0,5 mm). Wenn nach 4 d keine Aggregate sichtbar sind, wiederholen Sie Schritt 1.3. Sobald die Aggregate sichtbar sind, trennen und pflegen Sie die ESCs, wie in Abschnitt 2 beschrieben.

>2. ESC-Schaltung und Wartung

1. Übertragen Sie die ESC-Aggregate mit einer sterilen 10-ml-Pipette in ein konisches 15-ml-Röhrchen und lassen Sie die Aggregate zu einem kompakten Pellet absetzen (typischerweise 3 - 5 Minuten). Aspirieren Sie den Überstand, achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören, und waschen Sie die Aggregate mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Obwohl das Absetzen durch Schwerkraft empfohlen wird, können Sie alternativ Pelletzellen bei 100 x g für 2,5 min verwenden, um Zeit zu sparen.
2. PBS aspirieren und 500 μl Trypsin zugeben. Inkubieren Sie die Aggregate 3 Minuten lang in Trypsin in einem Wasserbad bei 37 °C. Geben Sie 500 μl ESC-Medium hinzu, um das Trypsin zu verdünnen, und zerkleinern Sie 10 Mal vorsichtig mit einer P1000-Pipette, um die Aggregate aufzubrechen. Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer.
3. Dissoziierte Zellen werden 3 min lang bei 200 x g pelletiert und auf eine Endkonzentration von 1,0 x 10⁷ Zellen/ml in ESC-Medium resuspendiert. 150 μl (1,5 x 10⁶ Zellen) in 10 ml frisches ESC-Medium in eine 10 cm große Bakterienschale geben und für 48 Stunden in den Gewebekultur-Inkubator zurückstellen. Überschüssige ESCs können differenziert, bei 1 - 5 x 10⁶ Zellen/ml in 90 % ESC-Medium, ergänzt mit 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO), kryokonserviert oder verworfen werden.
4. Die Durchgangszuschlagstoffe werden alle 48 Stunden durchgelassen. Die für den Durchgang bereiten Gesteinskörnungen mit Durchmessern von mehr als 0,5 mm sind deutlich sichtbar.
   Anmerkung: Das Auftauen und die Kultivierung von kryokonservierten, suspensionsadaptierten Zellen erfolgen gemäß den Schritten 1.2 - 1.4. Die Gesteinskörnungen sind innerhalb von 48 - 72 Stunden bereit für die Übergabe.

>3. Neuronale Differenzierung

HINWEIS: Führen Sie die Schritte 3.1 - 3.5 vor Mittag und Schritt 3.7 nach Mittag durch. Eine Übersicht über die Differenzierungsverfahren ist in Abbildung 1A dargestellt.

1. Dissoziieren Sie ESCs wie in den Schritten 2.1 - 2.5. 350 μl (3,5 x 10⁶) dissoziierte ESCs werden in eine 10 cm große Schale mit niedrigem Anhaftungsgrad mit 25 ml Differenzierungsmedium überführt. Auf einen auf 30 - 45 U/min eingestellten Orbitalschüttler in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ stellen. Dies ist der erste Tag der Differenzierung, der als Day in vitro (DIV) -8.
   bezeichnet wird. Anmerkung: Die Verwendung einer Schale mit extrem niedrigem Aufsatz erhöht die Kosten der Methode, führt jedoch zu etwas höheren Erträgen als bei bakteriellen Petrischale, da Aggregate gelegentlich an Petrischalen haften können. Mittlere Volumina und Zellzahlen können entsprechend skaliert werden, wenn unterschiedliche Schalengrößen bevorzugt werden.
2. Nach 48 Stunden (DIV -6) werden die differenzierenden Zellaggregate mit einer 25-ml-Pipette in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführt. Geben Sie sofort frische 25 ml Differenzierungsmedium in die Petrischale.
3. Lassen Sie die Zuschlagstoffe über 2 - 5 Minuten absetzen, wodurch ein sichtbares Pellet entsteht, das 1 - 2 mm tief ist. Ignorieren Sie einzelne Zellen oder kleine Aggregate, die in Suspension verbleiben. Saugen Sie das Medium vorsichtig an und übertragen Sie das Zellpellet mit einem P1000 zurück in die Petrischale. Auf einen Rotationsschüttler in einen Gewebekultur-Inkubator stellen.
4. Wiederholen Sie bei DIV -4 Schritt 3.2. Das Pellet wird 2 - 4 mm tief sein. 30 ml Differenzierungsmedium, das mit 6 μM all-trans-Retinsäure (RA) zugesetzt ist, werden in die Petrischale gegeben. Kehren Sie für weitere 48 Stunden in den Rotationsschüttler in den Gewebekultur-Inkubator zurück.
5. Wiederholen Sie bei DIV -2 Schritt 3.3. Das Pellet ist zu diesem Zeitpunkt 4 - 8 mm tief.
6. Bereiten Sie bei DIV -1 die Beschichtungsoberflächen wie in Abschnitt 4 vor.
7. Bei DIV 0 werden 5 ml Trypsinisierungsmedium für präaliquotierte und gefrorene neurale Vorläuferzellen (NPC) 5 - 10 Minuten lang bei 37 °C aufgetaut und in eine Gewebekulturhaube gegeben. Mit einer 25-ml-Pipette die differenzierenden Aggregate in ein konisches 50-ml-Röhrchen überführen. Lassen Sie die Zuschlagstoffe absetzen und saugen Sie das Medium vorsichtig an. Waschen Sie das Pellet zweimal mit 10 ml PBS, damit sich die Zuschlagstoffe zwischen den Wäschen absetzen können.
8. Nach der zweiten PBS-Wäsche 5 ml NPC-Trypsinisierungsmedium zum Pellet geben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Nach 2,5 min vorsichtig auf das Röhrchen schnippen.
9. Fügen Sie 5 ml 0,1% Soja-Trypsin-Hemmer (STI) hinzu, um Trypsin zu inaktivieren, und mischen Sie durch Invertieren. 10 - 15 Mal mit einer 10 ml serologischen Pipette vorsichtig zermalen, bis eine relativ homogene Zellsuspension entsteht.
10. Übertragen Sie die Zellsuspension langsam in ein 40 μm oder 70 μm Zellsieb, das auf einem konischen 50-ml-Röhrchen platziert ist. Sobald die gesamte Suspension filtriert wurde, fügen Sie 1 ml N2-Medium hinzu, um die verbleibenden Zellen durch den Filter zu waschen, und pelletieren Sie die dissoziierte Zellsuspension 6 Minuten lang bei 200 x g.
11. Saugen Sie das Medium an, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 ml N2-Medium, pelletieren Sie die Zellen für 5 min bei 200 x g und reiben Sie zwischen den Wäschen mit einem P1000. Zählen Sie vor dem zweiten Waschen die Zellen mit einem Hämozytometer.
12. Resuspendieren Sie Zellen in N2-Medium mit 1 x 10⁷ Zellen pro ml und plattieren Sie embryonale Stammzell-abgeleitete Neuronen (ESNs) mit einer Zelldichte von 150.000 - 200.000 Zellen/cm².
13. Neu plattierte ESNs werden bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator überführt und wie in Abschnitt 5 aufbewahrt.

>4. Vorbereiten von Kulturoberflächen für die Beschichtung neuronaler Vorläufer bei DIV 0

1. Bereiten Sie mit Gewebekulturen behandelte Gerichte mindestens 1 Tag vor dem Anrichten zu. Ausreichend Polyethylenimin (PEI; 25 μg/ml in sterilem H₂O) oder Poly-D-Lysin (PDL; 100 μg/ml in sterilem H₂O) zugeben, um mit Gewebekulturen behandelte Kunststoffschalen abzudecken und O/N bei 37 °C zu inkubieren.
2. Spülen Sie das Geschirr am Morgen des Anrichtens zweimal mit doppelt destilliertem H₂O und einmal mit PBS. Fügen Sie nach dem letzten Waschen ausreichend N2-Medium hinzu, um die Schale zu bedecken (z. B. 1 ml pro Mulde einer 12-Well-Schale oder 4 ml pro 6-cm-Schale).
Bereiten Sie mindestens
3. einen Tag vor der Neuronenbeschichtung 18-mm-Glasdeckgläser vor. Reinigen Sie die Deckgläser durch Plasmareinigung für 4 Minuten.
4. Gereinigte Deckgläser werden sofort auf einen mit Ethanol gewaschenen Parafilm am Boden einer großen sterilen Schale übertragen und 400 μl PEI- oder PDL-Lösung hinzugefügt, die wie in Schritt 4.1 hergestellt wurde. Über Nacht (O/N) bei 37 °C in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.
5. Waschen Sie die Deckgläser morgens dreimal mit Wasser und geben Sie 5 μg/ml Laminin in PBS für 1 - 3 Stunden bei 37 °C zu. Bevor Sie Neuronen dissoziieren, aspirieren Sie das Laminin und übertragen Sie das Deckglas sofort in eine Vertiefung einer 12-Well-Schale, die 1 ml NPC-Medium enthält, wobei darauf zu achten ist, dass die behandelte Seite nach oben zeigt.
6. Lagern Sie Geschirr und Deckgläser bei 37 °C, bis die NPCs zum Anrichten bereit sind.

>5. Wartung von Neuronen

1. Bei DIV 1 das Medium aspirieren und durch N2-Kulturmedium ersetzen.
2. Bei DIV 2 und 4 das Medium aspirieren und durch B27-Kulturmedium ersetzen.
3. Bei DIV 8 wird das Medium aspiriert und durch B27-Kulturmedium ersetzt, das mitotische Inhibitoren enthält, um kontaminierende nicht-neuronale Zellen zu eliminieren.
4. Bei DIV 12 durch B27-Nährmedium ersetzen.
5. Entfernen Sie DIV 12⁺ ESNs aus 5 % CO₂ nicht, bis sie fertig sind.

>6. Assay zur gemessenen Hemmung der synaptischen Transmission (MIST) zur Quantifizierung von exzitatorischen postsynaptischen Miniaturströmen

VORSICHT: Clostridien-Neurotoxine sind die giftigsten bekannten Substanzen, mit geschätzten LD_50-Werten beim Menschen von nur 0,1 - 1 ng/kg. Holen Sie die erforderlichen Genehmigungen ein, bevor Sie diese Giftstoffe verwenden, und treffen Sie geeignete Vorsichtsmaßnahmen.

1. Verdünnen Sie BoNT/A vorsichtig auf das 100-fache, die gewünschte Endkonzentration im ESN-Kulturmedium, und erwärmen Sie es auf 37 ºC. Geben Sie das entsprechende Toxinvolumen in die DIV 21+ ESN-Kulturen, schwenken Sie die Kulturschale und kehren Sie in den Inkubator zurück.
2. Wenn Zellen mehr als 4 Stunden nach der Vergiftung analysiert werden, fügen Sie der Schale ein Toxin hinzu und schwenken Sie, ohne 5% CO₂ zu entfernen, z. B. direkt im Inkubator oder in einer Kammer mit konstantem CO₂
-Gehalt.
3. Aspirieren Sie das ESN-Kulturmedium zum richtigen Zeitpunkt und waschen Sie es zweimal mit extrazellulärem Aufzeichnungspuffer (ERB). Fügen Sie 4 ml ERB hinzu, ergänzt mit 5,0 μM Tetrodotoxin und 10 μM Bicucullin, wodurch die Aktionspotentiale blockiert bzw. die GABA-A-Rezeptoraktivität antagonisiert werden.
4. Übertragen Sie die Schale in das Elektrophysiologie-Rig. Für den MIST-Assay ist weder eine Perfusion noch eine Temperaturkontrolle erforderlich.
5. Ziehen Sie Borosilikatglas mit einem Mikropipettenabzieher, um eine Aufzeichnungspipette mit einem Widerstand von 5-10 mΩ herzustellen, und füllen Sie es mit intrazellulärem Aufzeichnungspuffer. Tauchen Sie die gefüllte Aufnahmepipette vor der Aufnahme vorsichtig in ein silikonisierendes Reagenz.
6. Geben Sie mit einer luftgefüllten Spritze einen Überdruck an, während die Aufnahmepipette in den ERB abgesenkt wird. Nachdem Sie die Aufzeichnungspipette vorsichtig auf dem Soma des aufzuzeichnenden Neurons gelandet haben, entfernen Sie den Überdruck und bilden Sie einen Gigaseal. Verringern Sie die Haltespannung auf -70 mV. Üben Sie vorsichtig Unterdruck aus, um in die Ganzzellenkonfiguration zu brechen.
7. Schalten Sie auf die Stromzange um, um das Ruhepotenzial der Membran zu überwachen und aufzuzeichnen. Ohne Anpassung an die Potentiale der flüssigen Übergänge liegt das Potential der ruhenden Membran zwischen -67 und -82 mV.
8. Führen Sie eine kontinuierliche -70 mV-Spannungsklemmenaufzeichnung für 4 bis 5 Minuten durch, um erregende postsynaptische Miniaturströme (mEPSCs) zu detektieren.
9. Analysieren Sie 4 Minuten der aufgezeichneten Daten für die mEPSC-Erkennung mit der Spike-Erkennungssoftware mit den folgenden Einstellungen: Schwellenwert, 5; Zeitraum für die Suche nach einem lokalen Maximum, 10.000 μsec; Zeit vor einem Peak für die Baseline, 5.000 μsec; Zeitraum für die Suche nach einer Abklingzeit, 20.000 μsec; Bruchteil des Peaks, um eine Abklingzeit zu finden, 0,37; Zeitraum bis zum Mittelwert eines Ausgangswerts, 1.000 μsec; Bereichsschwelle, 20; Anzahl der Punkte bis zum durchschnittlichen Höchstwert, 1; Richtung des Peaks, negativ.
10. Sammeln und speichern Sie Informationen zu erkannten Ereignissen. Teilen Sie die Anzahl der erkannten Ereignisse in 4 min durch 240, um die mEPSC-Frequenz in Hz zu bestimmen.
11. Sammeln Sie mEPSC-Frequenzen für 8 - 12 Kontrollen und 8 - 12 BoNT-behandelte Proben für jede Expositionsbedingung. Analysieren Sie die Häufigkeit anhand von alters- und chargenübereinstimmenden Kontrollen. Bestimmen Sie die statistische Signifikanz der prozentualen Hemmung der synaptischen Aktivität unter Verwendung der Einweg-ANOVA und des Post-hoc-Tests von Dunnett.

Ergebnisse

Abbildung 1. Suspensionsangepasste ESNs bleiben mitotisch stabil und exprimieren Marker für Pluripotenz.(A) Schema der ESC-Wartung und -Differenzierung. Das Vorhandensein oder Fehlen von Retinsäure (RA) oder Leukämie-Hemmfaktor (LIF) wird mit einem + oder – gekennzeichnet. Es wird ein Vergleich zwischen Tagen in vitro (DIV) und klassischen Entwicklungsstadien (DS) für pri...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Tabelle 1. ESC und ESN
Knockout-DMEM	Lebenstechnologien	Tel.: 10829-018	Medium: ESC-Nährmedium
			Formulierung und Hinweise: 500 mL
100x MEM NEAA	Lebenstechnologien	Tel.: 11140-050	Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
			Rezeptur und Anmerkungen: 6 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamin	ATCC	Nr. 30-2115	6 mL
ES-qualifiziertes FBS	Verwendete Stammzellen	ASM-5007	90 mL
100x Antibiotika	Sigma-Aldrich	Nr. A5955	3 mL
55 mM 2-Mercaptoethanol	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 21985-023	1,1 mL
107 Einheiten/ml LIF	Millipore	ESG1107	60 μL
Knockout-DMEM	Lebenstechnologien	Tel.: 10829-018	Medium: ESC-Differenzierungsmedium
			Formulierung und Anmerkungen: 436,6 mL
100x MEM NEAA	Lebenstechnologien	Tel.: 11140-050	Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
			Formulierung und Anmerkungen: 5 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamin	ATCC	Nr. 30-2115	5 mL
ESC-qualifiziertes Serum	Verwendete Stammzellen	ASM-5007	50 mL
100x Antibiotika	Sigma-Aldrich	Nr. A5955	2,5 mL
55 mM 2-Mercaptoethanol	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 21985-023	0,9 mL
Dulbecco's PBS	Sigma-Aldrich	Nr. D8537	Medium: NPC-Trypsinisierungsmedium
			Formulierung und Hinweise: 100 mL
0,5 M EDTA (18,3 %)	Sigma-Aldrich	3690	Medium: Einfrieren in 5 mL Aliquote
			Rezeptur und Anmerkungen: 0,266 mL
Trypsin	Sigma-Aldrich	Nr. T8802	50 mg
Polyethylenimin (PEI)	Sigma-Aldrich	Nr. P3143	Medien: Lösungen für die Oberflächenbeschichtung
			Formulierung und Hinweise: 2,5 μg/mL in H20
Poly-D-Lysin (PDL)	Sigma-Aldrich	Nr. 7280	Medium: innerhalb von 1 Woche verbrauchen
			Formulierung und Hinweise: 100 μg/mL in H20
Laminin	Sigma-Aldrich	Nr. L2020	5 μg/mL in H20
DMEM/F12 + GlutaMAX	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 10565-018	Medien: NPC-Kulturmedium
			Rezeptur und Anmerkungen: 492,5 mL
100x N2 Vitamine	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17502-048	Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
			Formulierung und Anmerkungen: 5 mL
100x Antibiotika	Sigma-Aldrich	Nr. A5955	2,5 mL
Neurobasal A	Lebenstechnologien	Tel.: 10888-022	Medien: ESN-Kulturmedium
			Formulierung und Anmerkungen: 482,5 mL
50x B27 Vitamine	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 17504-044	Medien: bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern
			Formulierung und Hinweise: 10 mL
200 mM L-Alanyl-L-Glutamin	ATCC	Nr. 30-2115	5 mL
100x Antibiotika	Sigma-Aldrich	Nr. A5955	2,5 mL
5-Fluor-2'-Desoxyuridin (5FDU)	Sigma-Aldrich	Nr. F0503	Medien: 2000x Mitotische Inhibitoren aliquotieren und bei -20 °C lagern
			Formulierung und Anmerkungen: dd 150 mg 5FDU und 350 mg Uridin auf 10 mL Neurobasal A. Sterilfilter, aliquot und einfrieren. Verwenden Sie das 2000-fache im ESN-Kulturmedium.
Uridin	Sigma-Aldrich	U3003
TrypLE Express Trypsin	Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12605-010	Medien: Sonstiges
			Rezeptur und Notizen: bei RT lagern
Dmso	Sigma-Aldrich	Nr. D8418	Shop bei RT
Sojabohnen-Trypsin-Hemmer (STI)	Sigma-Aldrich	Nr. T6414	bei -20 °C lagern
Ethanol	Sigma-Aldrich	Nr. E7023	Shop bei RT
Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	Nr. A4403	Bereiten Sie 100 mM Brühe vor, indem Sie 100 mg Ascorbinsäure in 5,7 ml 50:50 DMSO/Ethanol-Mischung auflösen.
Retinsäure (RA)	Sigma-Aldrich	Nr. R2625	Resuspendieren Sie 15 mg RA in 9 mL 50:50 DMSO/Ethanol. Ergänzen Sie mit 1 mL 100 mM Ascorbinsäurebrühe. Aliquot und bei -80 °C gelagert. Stabil für 6 Monate.
Tabelle 2. Nebel
NaCl	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 71386	Medium: Extrazellulärer Aufnahmepuffer
			Endkonzentration (mM): 58,44
			MW: 140
Kcl	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 60135	Medien: (ERB; pH = 7,3, 315 mO)
			Endkonzentration (mM): 74,56
			MW: 3,5
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	Nr. S3139	Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
			Endkonzentration (mM): 119,98
			MW: 1,25
CaCl2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 21115	Endkonzentration (mM): 110,98
			MW: 2
MgCl2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 63069	Endkonzentration (mM): 95,21
			MW: 1
D-Glukose	Sigma-Aldrich	Nr. G8644	Endkonzentration (mM): 180,16
			MW: 10
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H0887	Endkonzentration (mM): 238,3
			MW: 10
K-Gluconat	Sigma-Aldrich	Nr. P1847	Medium: Intrazellulärer Aufzeichnungspuffer
			Endkonzentration (mM): 234,5
			MW: 140
NaCl	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 71386	Medien: (IRB; pH = 7,3, 320 mO)
			Endkonzentration (mM): 58,44
			MW: 5
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	Nr. A9187	Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
			Endkonzentration (mM): 507,18
			MW: 2
Li-GTP	Sigma-Aldrich	Nr. G5884	Endkonzentration (mM): 523,18
			MW: 0,5
CaCl2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 21115	Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
			Endkonzentration (mM): 110,98
			MW: 0,1
MgCl2	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 63069	Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
			Endkonzentration (mM): 95,21
			MW: 1
EGTA (EGTA)	Sigma-Aldrich	Nr. E3889	380.35 Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 mo. Endkonzentration (mM): 380,35 MW: 1
HEPES	Sigma-Aldrich	Nr. H0887	Medien: Stabil bei 4 °C für mindestens 6 Monate.
			Endkonzentration (mM): 238,3
			MW: 10
Bicuculline	Tocris	Nr. 131	Medien: Sonstiges
			Endkonzentration (mM): 0,01
			MW: 417,85
CNQX	Sigma-Aldrich	Nr. C239	Endkonzentration (mM): 0,01
			MW: 276,12
Tetrodotoxin	Sigma-Aldrich	Nr. A8001	Endkonzentration (mM): 0,005
			MW: 645,74
BoNT/A-/G	Metabiologika	N/A	Medien:
			Endkonzentration (mM): TBD
			MW: 150.000
Tetanustoxin	Sigma-Aldrich	Nr. T3194	Endkonzentration (mM): TBD
			MW: 150.000
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2	Endkonzentration (mM): N/A
			MW: N/A
Tabelle 3. Ausrüstung und Software
MiniAnalysis (Version 6.0.7)	Synaptosoft, Inc.	N/A	Software zur Ereigniserkennung
Igor Pro (Version 6.22A)	WaveMetrics (Englisch)	N/A	Software zur Visualisierung von Aufnahmen
Patchmaster	Heka	N/A	Software zur Datenerfassung
Olympus IX51 inverses Mikroskop	Olymp	N/A
Mikromanipulator	Sutter-Instrument	MPC-365
Patch-Clamp-Verstärker	Heka	ECB10USB
Abzieher für Mikropipetten	Sutter-Instrument	P-1000
Kapillarrohre aus Borosilikatglas	Sutter-Instrument	Artikel-Nr.: B150-86-10	Corning 7740
18 mm Deckgläser aus Glas	Fischer	Tel.: 12-545-84
Plasma-Reiniger	Harrick Plasma	PDC-32G
Zellsieb (40 μm)	Fischer	Tel.: 08-771-1
Stovall Bauchtänzerin Shaker	Fischer	Tel.: 15-453-211
Schalen mit geringer Adhäsion	Fischer	Tel.: 05-539-101	Corning 3262
Bakteriengerichte	VWR	Tel.: 25384-302	100 x 15 mm

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