Herstellung und Aufreinigung von rekombinanten Antikörpern aus Säugetierzellen

Zusammenfassung

Quelle: Shivange, Gururaj, et al. Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern. J. Vis.(2020).

Das Video erklärt den Prozess der Produktion von Antikörpern in Säugetier-Wirtszellen, von der Genexpression bis zur Sekretion. Es umfasst die Transkription, Translation, Signalerkennung, korrekte Faltung und schließlich die Freisetzung in das extrazelluläre Medium über sekretorische Vesikel.

Protokoll

>1. Expression und Reinigung von Antikörpern

1. Wartung von CHO-Zellen
   1. Züchten Sie CHO-Zellen in FreeStyle CHO Medien, ergänzt mit kommerziell erhältlichen 1x Glutaminpräparat bei 37 °C, Schütteln bei 130 U/min mit 5% CO₂ unter Verwendung von Delong-Erlenmeyerkolben, entweder Glas oder Einwegkolben.
      Anmerkung: Es wird dringend empfohlen, einen Kolben mit Blende und belüfteter Kappe zu verwenden, um die Bewegung zu erhöhen und die Gasübertragung unter Schüttelbedingungen zu verbessern. Eine signifikant reduzierte Antikörperausbeute wurde mit normalen Kolben (ohne Blende) aufgrund der begrenzten Bewegung der Suspensionskultur erzielt.
   2. Halten Sie die Zellzahl zwischen 1-5 x 10⁶ Zellen/ml mit >95% Zellviabilität. Wenn die Zellzahl über 5 x 10⁶ Zellen/ml zunimmt, teilen Sie die Zellen. Lassen Sie die CHO-Zellen niemals unter 0,2 x 10⁶ Zellen/ml fallen.
2. Transfektion von CHO-Zellen
   1. Züchten Sie CHO-Zellen in 200 mL Medium (2 x 10⁶ Zellen/ml) in langen Erlenmeyerkolben mit Blende.
      Anmerkung: Suspensionskulturen, die in Kolben ohne Kolben gezüchtet wurden, haben immer höhere Proteinerträge erzielt als in Kolben ohne Kolben.
   2. Nehmen Sie in einem 15-ml-Röhrchen 5 ml CHO FreeStyle-Medien und fügen Sie 50 μg VH-Klon-DNA und 75 μg VL-Klon-DNA hinzu. Vortex, um gut zu mischen.
   3. Inkubieren Sie das DNA-Gemisch bei Raumtemperatur für 5 min.
      Anmerkung: Eine längere Inkubation reduziert die Proteinausbeute.
   4. Geben Sie 750 μl 1 mg/ml Polyethylenimin (PEI)-Stamm in die DNA-Lösung und wirbeln Sie die Mischung aggressiv für 30 Sekunden. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur für weitere 5 min.
      Anmerkung: PEI muss frisch hergestellt werden. Mehrfacher Frost-Auftauzyklus von PEI reduziert den Gesamtertrag erheblich.
   5. Geben Sie die gesamte Mischung aus DNA und PEI in die Zellen, während Sie den Kolben manuell schütteln. Die Delong-Erlenmeyerkolben mit Schwallkolben werden sofort bei 37 °C inkubiert und bei 130 U/min geschüttelt.
3. Ausdruck
   HINWEIS: Der Antikörper verfügt über ein sekretorisches Signalpeptid, das an sein N-terminales Ende angepasst ist und die Sekretion von Antikörpern in das Medium unterstützt.
   1. Züchten Sie die transfizierten Zellen bei 37 °C und schütteln Sie sie an Tag 1 bei 130 U/min.
   2. Fügen Sie an Tag 2 2 ml 100x Anti-Klumpen-Mittel und 2 ml 100x antibakteriell-antimykotische Lösung hinzu. Den Kolben auf eine niedrigere Temperatur (32-34 °C) stellen und bei 130 U/min schütteln.
   3. Fügen Sie an jedem fünften Tag 10 ml Trypton N1-Futter und 2 ml 100x Glutamin-Ergänzungsmittel hinzu.
   4. Zählen Sie die Zellen jeden dritten Tag mit einem Hämozytometer, nachdem Sie ein Aliquot von Zellen mit einem Trypanblau-Fleck gefärbt haben. Stellen Sie sicher, dass die Zellviabilität über 80 % bleibt.
   5. Ernten Sie am 10. oder 11. Tag das Medium für die Antikörperreinigung. Schleudern Sie die Kultur bei 3000 x g, 4 °C für 40-60 min und filtrieren Sie dann das klare Medium mit 0,22 μM Flaschenfiltern.
4. Reinigung
   Anmerkung: Die Antikörperaufreinigung wird mit einer kommerziell erhältlichen Protein-A-Säule (siehe Materialtabelle) unter Verwendung einer Peristaltikpumpe durchgeführt.
   1. Die Säule wird mit einem zweispaltigen Volumen Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat bei pH 7,4) äquilibriert.
   2. Das filtrierte Medium, das Antikörper enthält (erhalten in Schritt 1.3.5), wird mit einer Flussrate von 1 ml/min durch die Säule geleitet.
   3. Waschen Sie die Säule mit einem zweispaltigen Volumen Bindepuffer.
   4. Eluieren Sie den Antikörper in 500-μl-Fraktionen mit 5 ml-Elutionspuffer (30 mM Natriumacetat bei pH 3,4).
   5. Neutralisieren Sie den pH-Wert des eluierten Antikörpers durch Zugabe von 10 μl Neutralisationspuffer (3 M Natriumacetat bei pH 9) pro Fraktion.
      Anmerkung: Die Fraktionsnummern 3-6 enthalten den größten Teil des Antikörpers. Es ist ratsam, alle Fraktionen aufzubewahren, falls der Antikörper in einer späteren Fraktion als erwartet eluiert wird.
   6. Messen Sie die Konzentration des gereinigten Antikörpers mit einem Spektralphotometer, indem Sie das Standardprotokoll für IgG auswählen. Die endgültige Konzentration des Antikörpers wird unter Berücksichtigung des Molekulargewichts und des Absorptionskoeffizienten in mg/ml ermittelt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
FreeStyle CHO Medien	Gibco Life Technologien	Katze # 12651-014
Anti-Anti-Anti (100-fach)	Gibco Life Technologien	Katze # 15240-062
Anti-Klumpen-Mittel	Gibco Life Technologien	Katze # 01-0057DG
BD Insulin Spritze	BD Biowissenschaften	Katze #329420
Messschieber IVIS Spectrum	PerkinElmer	Katze #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologien	Kat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium)	Corning	Kat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Kat # 10-040-CV
Cy5-konjugiertes Anti-Human-IgG (H+L)	Jackson Immunforschung	Katze # 709-175-149
GlutaMax-I (100-fach)	Gibco Life Technologien	Katze # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen	Katze # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Säule	GE Gesundheitswesen	Katze # 11-0034-93
Isofluran, Alleinstellungsmerkmal	Covetrus	Katze # 11695-6777-2
Gleitmittel Augensalbe	Lacri-Lube auffrischen	Katze #4089
PEI-Transfektionsreagenz	Thermo Fischer	Katze # BMS1003A
Experimentelle Modelle: Zelllinien
Mensch: OVCAR-3	Sammlung amerikanischer Schriftkultur	ATCC HTB-161
Mensch: CHO-K-Zellen	Stabil transformiert in unserem Labor	ATCC CCL-61
Maus: 4T1	Freundliches Geschenk von Dr. Chip Landen, UVA
Maus: MC38	Freundliches Geschenk von Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Authentifizierung durch STR-Profilerstellung