Messung der Aktivierung von Fc-vermittelten Effektorfunktionen durch HA-Antikörper

Zusammenfassung

Quelle: Bailey, M. J., et al. Eine Methode zur Bewertung von fc-vermittelten Effektorfunktionen, die durch Influenza-Hämagglutinin-spezifische Antikörper induziert werden. J. Vis. Exp. (2018).

Dieses Video zeigt einen Assay, der die Antikörper-vermittelte Aktivierung von T-Zell-Effektorfunktionen misst. Die Zugabe eines Influenzavirus-Hämagglutinin (HA)-spezifischen monoklonalen Antikörpers zu transfizierten Säugetierzellen, die HA exprimieren, führt zur Bildung von Immunkomplexen mit HA. Nach der Einführung von gentechnisch veränderten T-Zellen, die Fc-Rezeptoren und einen Luciferase-Reporter exprimieren, werden die T-Zellen durch die Antikörper-HA-Komplexe aktiviert, und diese Aktivierung wird durch Zugabe eines Luciferase-Substrats und Messung der produzierten Biolumineszenz nachgewiesen.

Protokoll

>1. Expression von Influenzavirus-Hämagglutinin durch Transfektion

1. Platten von humanen embryonalen Nierenzellen (HEK 293T) mit einer Dichte von 2 x 10⁴ Zellen/Well in einer mit Weißgewebekultur behandelten 96-Well-Platte und lassen Sie sie 4 Stunden lang in einem 37 °C heißen Inkubator (mit 5 % CO₂) ruhen.
2. Transfiziert Zellen mit 100 ng DNA, die für virales Hämagglutinin kodiert, und 0,2 μl Transfektionsreagenz pro Vertiefung in einem Gesamtvolumen von 50 μl.
   Anmerkung: Sowohl das Plasmid als auch das Transfektant-Reagenz werden in 1x Opti-Minimum Essential Media (MEM) reduziertem Serummedium verdünnt.
3. Nach 18 h Inkubation der Platten in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ ist das Transfektionsmedium zu entfernen.

>2. Bewertung der FcRg/NFAT-vermittelten Aktivierung der Luciferase-Aktivität durch monoklonale Antikörper oder Seren

1. Ersetzen Sie zunächst das Wachstumsmedium der transfizierten Zellen durch 25 μl Assay-Medium (1x RPMI 1640, ergänzt mit 4 % (vol/vol) fötalen Rinderseren mit niedrigem IgG-Gehalt).
2. Führen Sie in einer separaten 96-Well-Platte vierfache Verdünnungen der interessierenden Antikörper ab 30 μg/ml unter Verwendung des Assay-Mediums durch. Führen Sie Verdünnungen in dreifacher Ausführung durch, und ein Beispiel für ein Plattenlayout ist in Abbildung 1A dargestellt. Stellen Sie sicher, dass eine Kontrolle, die Antikörper ausschließt (keine Antikörperkontrolle), und eine Hintergrundkontrolle (Assay-Puffer allein) enthalten ist.
   Anmerkung: Sowohl für die "Kein Antikörper"- als auch für die Hintergrundkontrolle fügen Sie 25 μl Assay-Puffer anstelle des Antikörpers hinzu.
3. Übertragen Sie 25 μl der seriell verdünnten Antikörper aus Schritt 2.2 in entsprechende Vertiefungen auf der Platte der transfizierten Zellen.
4. Platte in einem 37 °C heißen Inkubator (mit 5 % CO₂) für 15 min inkubieren.
5. 25 μl des entsprechenden modifizierten Effektors Jurkat-Zelle, die murines FcgRIV oder humanes FcgRIIIa exprimiert, zugeben (75.000 Zellen/Well). Das Gesamtvolumen für jede Vertiefung sollte 75 μl betragen, und die Ausgangsendkonzentration des Antikörpers liegt bei 10 μg/ml (Abbildung 1B).
   Anmerkung: Für die Hintergrundkontrolle fügen Sie 25 μl Assay-Puffer anstelle von Effektorzellen hinzu. Um die Antikörper-abhängige zellvermittelte Phagozytose zu untersuchen, kann eine modifizierte Jurkat-Zelle, die das humane FcgRIIa exprimiert, verwendet werden.
6. Inkubieren Sie die Platte in einem 37 °C heißen Inkubator mit 5 % CO₂ für 6 h.
7. Vor Gebrauch den Luciferase-Substratpuffer in 37 °C heißem Wasser auftauen und ca. 1 h erwärmen.
   Anmerkung: Um den Luciferase-Substratpuffer herzustellen, rekonstituieren Sie das lyophilisierte Luciferase-Assay-Substrat in dem bereitgestellten Assay-Puffer. Der rekonstituierte Substratpuffer kann bei -30 °C bis -10 °C bis zu sechs Wochen gelagert werden.
8. Geben Sie 75 μl/Vertiefung Luciferase-Substratpuffer in alle Vertiefungen mit Ausnahme der Hintergrundkontrolle.
9. Lesen Sie auf einem Luminometer ab.
10. Berechnen Sie die Falteninduktion mit der folgenden Gleichung: Falteninduktion = (Induzierter Wert-Hintergrundwert) / (Kein mAb-Wert-Hintergrundwert).

Ergebnisse

Abbildung 1: Ein Schema des Layouts einer Probenplatte und der Zusammensetzung der Versuchsgruppen. (A) Die Ausgangskonzentration für jede Antikörperprobe liegt bei 10 μg/ml und wird seriell über die Platte (Spalte 1 bis Spalte 12) um das 4-fache verdünnt. Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Zeile G ist für das Steuerelement ohne mAb reserviert, und Zeile H is...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK 293T Zellen	ATCC	CRL-3216	Menschliche embryonale Nierenzellen
Lipofectamin 2000	Lebenstechnologien	11668019	Transfektionsreagenz
1X Opti-MEM Reduziertes Serummedium	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 51985-034
Mit weißer Gewebekultur behandelte 96-Well-Platte	Corning, Inc.	3917	Assay-Platten
10X MEM	Gibco	Artikel-Nr.: 11430-030
Jurkat-Zelle, die murines FcgRIV exprimiert	Promega	M1201	Das Kit enthält Zellen, ein Bio-Glo Luciferase Assay-System, 1X RPMI und Serum mit niedrigem IgG-Gehalt
Jurkat-Zelle, die humanes FcgRIIIa exprimiert	Promega	G7010	Das Kit enthält Zellen, ein Bio-Glo Luciferase Assay-System, 1X RPMI und Serum mit niedrigem IgG-Gehalt
Jurkat-Zelle, die humanes FcgRIIa exprimiert	Promega	Nr. G9901	Das Kit enthält Zellen, ein Bio-Glo Luciferase Assay-System, 1X RPMI und Serum mit niedrigem IgG-Gehalt
Luminometer	BioTek	Synergy H1 Multi-Mode-Lesegerät	Lumineszenzplatten-Lesegerät
Bio-Glo Luciferase Assay-System	Promega	Nr. G7940	Enthält Luciferase-Assay-Puffer und Luciferase-Assay-Substrat