Entstehung von Influenzavirus-Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper

HINWEIS: HA-spezifische Antikörper, die die virale Replikation hemmen, können im Allgemeinen in i) solche, die an oder neben der Rezeptorbindungsstelle auf dem Kugelkopf binden, und ii) solche, die distal der Rezeptorbindungsdomäne binden, die die laterale Seite des Kugelkopfes und die Stielregion des HA umfasst, kategorisiert werden. Antikörper, die auf die Rezeptorbindungsstelle abzielen, verhindern die Bindung von Sialinsäuremotiven auf der Oberfläche von Zielzellen und können mit einem Hämagglutinationshemmungstest (HI) gemessen werden. Antikörper, die HI-negativ sind, wie z. B. stängelspezifische Antikörper, können die Virusreplikation immer noch hemmen, können aber nur mit Neutralisationsassays bewertet werden.

>1. Kategorisierung von Antikörpern basierend auf HI-Aktivitäten

1. HI-Assay
   1. Geben Sie in einer 96-Well-V-Bodenplatte 25 μl 1x PBS auf die Spalten 2 bis 12.
   2. Verdünnen Sie den monoklonalen Antikörper (mAb) 7B2 (kopfspezifisch), 6F12 (stielspezifisch) und eine Isotypkontrolle auf 100 μg/ml in 1x PBS und aliquotieren Sie 50 μl der verdünnten Antikörperpräparate in Spalte 1. Fügen Sie auch eine No-mAb-Kontrolle hinzu, indem Sie 50 μl 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) hinzufügen (Abbildung 1A).
   3. Führen Sie 2-fache serielle Verdünnungen der Antikörper durch, indem Sie 25 μl von Spalte 1 in Spalte 2 usw. übertragen. Die letzten 25 μl aus Spalte 12 (Abbildung 1A) verwerfen.
      Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass Sie eine Reihe ohne Antikörperkontrolle einschließen.
   4. Der Virusbestand (ein Reassortantvirus, das das Hämagglutinin (HA) und die Neuraminidase (NA) von A/California/04/09 exprimiert, wird mit den internen Segmenten von A/Puerto Rico/8/34 auf 8 Hämagglutinationseinheiten/25 μl verdünnter Virusbestand verdünnt. Geben Sie 25 μl des verdünnten Virusstamms (8 Hämagglutinationen) in jede Vertiefung (Reihen A bis G).
      Anmerkung: Das Antikörper-Virus-Gemisch sollte ein Endvolumen von 50 μl mit einer Ausgangsendkonzentration von 50 μg/ml haben.
   5. Inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur (RT) für 45 min.
   6. Für die Rücktitrationsreihe (H) werden 50 μl 1x PBS in die Vertiefungen H2 bis H12 gegeben. Geben Sie 100 μl der 8 Hämagglutinationseinheiten/25 μl in die Vertiefung H1. Seriell zweifach verdünnen, indem 50 μl von H1 auf H2 übertragen werden usw. Die letzten 50 μl aus der Vertiefung H12 verwerfen. Zum Schluss werden 50 μl 0,5 % rote Blutkörperchen (RBC) von Hühnern in alle Vertiefungen der 96-Well-V-Bodenplatte gegeben.
      Anmerkung: Die mAb-Proben im Assay sollten ein Endvolumen von 100 μl haben: mAb (25 μl), Virus (25 μl) und RBC (50 μl). Das endgültige Volumen der No-mAb-Kontrolle sollte 25 μl 1x PBS, 25 μl Virus und 50 μl RBC enthalten.
   7. Die Platte 1 h lang bei 4 °C inkubieren.
   8. Lesen Sie die Platten visuell für die HI-Aktivität ab. Wenn es einen positiven Messwert für einen bestimmten Antikörper gibt, fahren Sie mit Schritt 2.1 fort, um Escape-Varianten zu generieren. Wenn der Antikörper HI-negativ ist, fahren Sie mit Schritt 1.2 fort, um zu beurteilen, ob der Antikörper in einem Zellkulturassay eine neutralisierende Aktivität aufweist.
      Anmerkung: Ein positiver Messwert eines HI-aktiven mAb wird durch ein dunkelrotes Erythrozyten-Pellet in der Mitte eines Wells angezeigt (Abbildung 1B; 7B2), das einen Tränen bildet, wenn die 96-Well-V-Bodenplatte in einem 45°-Winkel gehalten wird. Ein negativer Messwert führt nicht zu einem dunkelroten Erythrozyten-Pellet in der Vertiefung (Abbildung 1B; 6F12 und kein mAb). Die Isotypkontrolle bildet auch kein dunkelrotes Erythrozytenkügelchen und sollte identisch mit dem stielspezifischen Antikörper 6F12 oder der Kontrollprobe ohne mAb aussehen (Abbildung 1B).

>2. Erzeugung von Escape-Mutanten-Varianten

HINWEIS: Neutralisierende Antikörper, die HI-Aktivität aufweisen oder fehlen, werden mit den unten beschriebenen spezifischen Protokollen weiter analysiert.

1. Protokoll 1: HI-positive/neutralisationspositive Antikörper (Abbildung 2A)
   1. Bereiten Sie einen Virusbestand von 10⁶ plaquebildenden Einheiten/Milliliter (PFU/ml) in 1x PBS in einem Volumen von 400 μl vor.
   2. Bereiten Sie vier Verdünnungen des Antikörpers von Interesse in steigenden Konzentrationen (z. B. 0, 0,5, 0,05 und 0,005 mg/ml) in 1x PBS in einem Volumen von 100 μl pro Verdünnung vor.
      HINWEIS: Wildtyp-Viren sollten immer parallel und in Abwesenheit von Antikörpern verabreicht werden. Die Sequenzen dieser passageierten Viren werden helfen, zwischen der Anpassung an Zellkulturbedingungen und Escape-Mutationen zu unterscheiden.
   3. Mischen Sie 100 μl 10⁶ PFU/ml Virus mit 100 μl jeder Antikörperverdünnung oder 100 μl 1x PBS.
   4. 1 h in einem 37 °C heißen Inkubator (mit 5 % CO₂) inkubieren. Kurz vortexen. Injizieren Sie 200 μl jeder Mischung in embryonisierte Hühnereier ohne spezifische Krankheitserreger (SPF).
   5. Die Eier bei 37 °C (ohne CO₂) 40-44 h inkubieren.
   6. Die mit dem Virus infizierten embryonierten Eier werden durch Inkubation bei 4 °C für mindestens 6 Stunden getötet
   .
   7. Ernten Sie die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern, wie zuvor beschrieben.
   8. Führen Sie den Hämagglutinationstest wie oben beschrieben durch. Wenn nicht alle Allantoisflüssigkeitspräparate Hämagglutinationstiter haben, wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2 mit Antikörperverdünnungen im Bereich von 0,005 mg/ml bis 0,00005 mg/ml.
      Anmerkung: Eine Sättigungskonzentration eines HI-positiven Antikörpers kann alle vorhandenen Viruspartikel neutralisieren. Daher kann es notwendig sein, die Menge an Antikörpern, die in der Passage vorhanden sind, zu verringern.
   9. Bestätigen Sie die Escape-Varianten, indem Sie den HI-Assay durchführen (Schritt 1.1).
      Anmerkung: HI-aktive Antikörper blockieren die HA-Bindung von Sialinsäure-Motiven an die Zielzellen. Daher verliert ein Virus in Gegenwart seines verwandten Antikörpers die Fähigkeit, Erythrozyten zu verkleben (Vorhandensein von Erythrozytenpellets). Theoretisch können Escape-Varianten von HI-aktiven Antikörpern auch in Gegenwart ihres verwandten Antikörpers Sialinsäure-Motive binden und somit Erythrozyten agglutinieren (kein Erythrozyten-Pellet). Wenn die HI des interessierenden Antikörpers noch nachweisbar ist, wiederholen Sie das Protokoll aus Schritt 2.1.2 mit einer höheren Anfangskonzentration des Antikörpers.

Abbildung 1: HI-Assay. (A) Ein Schema für die Einrichtung eines HI-Assays zum Testen der Aktivität von zwei Maus-H1-spezifischen mAbs 7B2 (kopfspezifisch) und 6F12 (stielspezifisch) unter Verwendung einer 96-Well-V-Bodenplatte, und (B) ein Beispiel für die Ergebnisse eines HI-Assays

Abbildung 2: Erzeugung von Escape-Mutanten. Die vorgeschlagene Methodik hängt von der HI und der Mikroneutralisationsaktivität des Antikörpers ab. Die Erzeugung von Escape-Mutanten gegen (A) neutralisierende HI-positive Antikörper kann eine einzige Passage in Eiern erfordern, während (B) neutralisierende HI-negative Antikörper mehrere Passagen mit steigenden Antikörpermengen in der Zellgewebekultur umfassen kann.