Erzeugung rekombinanter monoklonaler Antikörper aus Säugetierzellkulturen

Zusammenfassung

Quelle: Nogales-Gadea, G. et al., Generation von rekombinanten humanen monoklonalen IgG-Antikörpern aus immortalisierten sortierten B-Zellen.J. Vis. Exp.(2015)

Dieses Video demonstriert eine Methode zur Erzeugung von Antikörpern aus Säugetierzellen durch Einführung von Plasmidvektoren mit schweren und leichten Kettengenen. Diese Vektoren interagieren mit Polyethylenimin und gelangen durch Bildung von Polyplexen in die Zellen; Später werden sie in einzelne Proteine übersetzt und zu vollständigen Antikörpern zusammengesetzt, die in das extrazelluläre Medium sezerniert werden.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs)

1. Zentrifugieren Sie 25 ml des heparinisierten Blutes der Teilnehmer bei 900 x g für 15 Minuten, so bald wie möglich nach der Blutentnahme. Wenn weniger Blut vorhanden ist, verkleinern Sie die Reagenzien entsprechend. Führen Sie alle nächsten Schritte in einer Haube aus.
2. Füllen Sie das Serum in eine saubere Tube. Es kann in späteren Schritten zum Einfrieren von PBMCs oder bei Autoimmunpatienten zum Testen von Autoantikörpern verwendet werden.
3. Verdünnen Sie das Blut mit 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medien und resuspendieren Sie die Zellen durch Auf- und Abpipettieren.
4. 15 ml einer Lösung, die Polysaccharose und Natriumdiatrizoat (1,077 g/ml) enthält, werden in ein neues 50-ml-Röhrchen gegeben.
5. In Schritt 1.4 wird das Blut vorsichtig auf die Lösung aufgetragen, indem die beiden Öffnungen der Röhrchen eng aneinander herangeführt werden, bis die beiden Flüssigkeiten sehr langsam in Kontakt kommen, und dann die PBMC-Suspension langsam auf das 50-ml-Röhrchen dekantieren. Dieser Schritt ist entscheidend für eine gute Trennung der PBMCs.
6. Das in Schritt 1.5 erhaltene Röhrchen bei 400 x g ohne Bremse bei Raumtemperatur (RT) wird 20 min lang zentrifugiert.
7. Nach der Zentrifugation wird mit der Pipette der weiße Ring zurückgewonnen, der sich im mittleren Teil des Röhrchens befindet und in dem sich die PBMCs befinden.
8. Waschen Sie die Zellen mit 25 ml RPMI 1640 Medien.
9. 300 x g bei RT für 10 min zentrifugieren.
10. Den Überstand verwerfen und die Zellen mit 10 ml RPMI 1640 waschen. Erneut zentrifugieren wie in Schritt 1.9.
11. Zählen Sie die PBMCs mit einer Neubauer-Kammer, wie zuvor berichtet.
12. Die PBMC sind wie in Abschnitt 2 beschrieben zu verarbeiten oder für die spätere Verwendung wie folgt zu lagern: 10 Millionen PBMC zum Einfrieren pro Kryoröhrchen, verdünnt in 1 ml 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) und 90 % Serum, erhalten in Schritt 1.2. Schrittweise und für lange Lagerung in flüssigem Stickstoff einfrieren.

>2. Färbung von PBMCs zur Sortierung von CD22+ und Immunglobulin G (IgG+) durch Zellzytometrie

1. Die PBMCs werden in einen 25 cm großen 2-Zell-Kulturkolben mit 6 ml vollständigem RPMI 1640-Medium (ergänzt mit L-Glutamin, 10 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)-Puffer, 50 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin und 10 % fötalem Rinderserum) überzogen und im Inkubator bei 37 °C bei 5 % Kohlendioxid (CO₂) O/N zurückgewonnen.
2. Sterile Röhrchen für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) über Nacht mit steriler 4%iger Albuminphosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) blockieren. Waschen Sie die Röhrchen zweimal mit PBS und füllen Sie sie mit 500 μl vollständigem RPMI 1640 Medium. Verwenden Sie diese Röhrchen zur Rückgewinnung der Zellen nach dem Sortieren.
3. Sammeln Sie die PBMCs in einem Röhrchen und zentrifugieren Sie sie bei 400 x g bei RT für 5 min.
4. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Markierungspuffer (siehe Schritte 2.5 und 2.6) und zählen Sie sie. Der Markierungspuffer besteht aus sterilem 2 % fötalem Rinderserum und 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS.
5. Bereiten Sie 3 FACS-Röhrchen mit je 10⁵ Zellen vor und resuspendieren Sie sie in 100 μl Markierungspuffer. Diese Rohre dienen zur Definition der Tore der Sortierung.
   1. In das erste Röhrchen geben Sie 5 μl Anti-CD22-PerCP-Antikörper (empfohlen im Datenblatt des Herstellers), in das zweite Röhrchen 20 μl Anti-IgG-PE (empfohlen im Datenblatt des Herstellers) und nichts in das dritte Röhrchen. Auf Eis und im Dunkeln 30 min inkubieren.
6. Resuspendieren Sie 5 Millionen Zellen in 200 μl Markierungspuffer in einem FACS-Röhrchen und fügen Sie 10 μl Anti-CD22 PerCP und 40 μl Anti-IgG PE hinzu. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis und dunkel. Wenn eine höhere Anzahl von Zellen sortiert werden soll, skalieren Sie alle Reagenzien hoch.
7. Zellen bei 400 x g mit niedriger Bremse für 5 min bei RT zentrifugieren.
8. Den Überstand sanft dekantieren.
9. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 μl Markierungspuffer. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 x g mit einer niedrigen Bremse für 5 min bei RT. Wiederholen Sie die Schritte 2.7 und 2.8
10. Deformieren Sie den Überstand sanft und resuspendieren Sie die Zellen in 300 μl RPMI-Komplettmedium.
11. Lassen Sie die Zellen durch einen 0,45 μm Filter. Die Zellen sind bereit zum Sortieren.

>3. Sortierung der B-Zellen CD22+ und IgG+

1. Verwenden Sie 3 Kontrollröhrchen, um die Lebensfähigkeit der Zellen festzustellen. Verwenden Sie in der Kontrolle ohne Färbung das Vorwärts- und Größenstreudiagramm, um das Lymphozyten-Gating zu definieren. Die Kontrollen mit dem CD22 PerCP und Anti-IgG PE dienen zur Einrichtung der Gates und des Sortiergates. Führen Sie die folgenden zuvor gemeldeten Daten aus.
   HINWEIS: Ein Gatter ist eine Reihe von Wertgrenzen (Grenzen), die dazu dienen, eine bestimmte Gruppe von zytometrischen Ereignissen, in unserem Fall Zellen, aus einer großen Menge zu isolieren. Im Falle eines Sortiergatters ermöglichen die Wertgrenzen die Wiederherstellung der zytometrischen Ereignisse, Zellen, die innerhalb der definierten Grenzen CD22+ und IgG+ liegen.
2. Als Sammelröhrchen in der Sortierung sind die verstopften Röhrchen mit 500 μl vollständigem RPMI 1640 Medium, das aus Schritt 2.2 gewonnen wurde, zu verwenden.
3. Fahren Sie fort, um doppelt positiv zu sortieren: CD22+ IgG+. Notieren Sie sich die endgültige Anzahl der Zellen in jeder Bedingung. Plattensortierte Zellen so schnell wie möglich auf die Zuführzellen aufsetzen.

>4. Bestrahlung von Feederzellen

HINWEIS: Führen Sie die Vorbereitung der Feederzellen zwischen 1 und 3 Tagen vor der Sortierung durch. Pro Well werden mindestens 5.000 wi38-Zellen in einer 96-Round-Well-Platte benötigt. Führen Sie die Schritte 4.1, 4.2 und 4.4 in einer Haube aus.

1. Kultivieren Sie die wi38-Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ in vollständigem RPMI 1640-Medium (wie bei PBMCs), bis die gewünschte Zellzahl erreicht ist.
2. Bestrahlen Sie sie mit 50 Gray nach einem zuvor beschriebenen Protokoll. Die Bestrahlung ist durchzuführen, nachdem die wi38-Zellen trypsinisiert und in vollständigem RPMI-Medium resuspendiert wurden, oder wenn wi38 an den Kulturkolben gebunden und nach der Bestrahlung trypsinisiert wurde. Befolgen Sie die vom Lieferanten der WI38-Zellen angegebene Methode zur Trypsinisierung. Bestrahlen Sie die Anzahl der Zellen, die erforderlich ist, um die für die Beschichtung von IgG+ B-Zellen erforderlichen Vertiefungen abzudecken (1 % der gesamten PBMC, gezählt in Schritt 1.11).
3. Platte 90 μl mit 5.000 bestrahlten wi38-Zellen in jeder Vertiefung der 96-Round-Well-Platte. Lassen Sie die Vertiefungen in der äußeren Reihe der Platte leer (da sie schneller verdampfen) und verwenden Sie nur die 60 Vertiefungen in der Mitte der Platte zum Plattieren von Zellen. Füllen Sie die äußeren Vertiefungen, die die Platte umrahmen, mit 200 μl PBS.
4. Stellen Sie sie bis zur Verwendung bei 37 °C und 5 % CO₂ in einen Inkubator.

>5. Plattierung sortierter PBMCs, Epstein-Barr-Virus (EBV)-Infektion und wachsend

1. Verdünnen Sie die sortierten PBMCs, um 50 Zellen in 50 μl RPMI 1640 vollständiges Medium pro Vertiefung in der 96-Round-Well-Platte zu plattieren (zuvor mit WI38-bestrahlten Zellen plattiert). Führen Sie Arbeitsschritte in einer Haube aus, die für EBV-Arbeiten ausgerüstet ist.
   HINWEIS: Die Infektion von 50 Zellen pro Well ist optimiert und erhöht die Wahrscheinlichkeit, einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, es wird jedoch empfohlen, dies durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zu überprüfen, wie zuvor beschrieben.
2. 60 μl EBV-Überstand (mit 3 - 4 x 10⁸ Viruskopien/ml) in jede Vertiefung in der 96-Runden-Well-Platte geben. Bei EBV-Arbeiten ist Vorsicht geboten.
3. Fügen Sie 1 μg/ml CpG (ODN2006) pro Vertiefung hinzu.
4. Lassen Sie die Zellen in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂.
5. Überwachen Sie das Wachstum des Klons unter dem Mikroskop nach einer Woche visuell.
   HINWEIS: Einige Beispiele für das Wachstum von B-Zellen sind unten im Abschnitt "Ergebnisse" zu sehen. Beachten Sie, dass die Wachstumsraten der Klone variieren können und zusätzliche Zeit erforderlich sein kann, um zu sehen, wie etwas Zellmasse in der Mitte der Vertiefung wächst.
6. Nach den ersten zwei Wochen Überwachen Sie das Wachstum des Klons unter dem Lichtmikroskop und fahren Sie mit dem ersten Medienaustausch fort. Pipettieren Sie langsam 90 μl Medium aus dem oberen Teil der Vertiefung und sammeln Sie es in einer sauberen 96-Well-Platte. (B-Zellen liegen im Boden der Vertiefung, so dass keine Gefahr besteht, sie abzusaugen).
   1. In jede Vertiefung werden 100 μl vollständiges RPMI 1640-Medium gegeben, ergänzt mit 1 μg/ml CpG (ODN2006) und 50 U/ml IL2. Wenn Klone wachsen, analysieren Sie diesen ersten Medienaustausch mit einem Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) wie in Schritt 6.
7. Überwachen Sie das Klonwachstum und wechseln Sie das Medium nach der 3^. und 4^. Woche des Wachstums erneut, indem Sie 90 μl Medium entnehmen und 100 μl vollständiges RPMI 1640 Medium hinzufügen, ergänzt mit 1 μg/ml CpG (ODN2006) und 50 U/ml IL2. Verwenden Sie den gesammelten Überstand, um die IgG-Produktion per ELISA zu überwachen, wie in Schritt 6.
   HINWEIS: Nach einem Monat sollte das Klonwachstum durch die Beobachtung von Aggregaten runder Zellen erkennbar sein, die normalerweise in der Mitte der Vertiefung mit rundem Boden liegen.
8. Wechseln Sie in diesem Schritt das Medium auf die gleiche Weise wie in den vorherigen Wochen, jedoch nur mit vollständigen RPMI 1640-Medien. Ein guter Indikator, um den richtigen Zeitpunkt für einen Medienwechsel zu kennen, ist die Medienfarbe, wenn sie gelblich wird, benötigen Zellen einen Medienaustausch.
9. Wenn 96-Well-Platten große Klone (ca. 5 x 10⁵ Zellen) enthalten, übertragen Sie diese in eine flache Vertiefung einer 24-Well-Platte. Geben Sie 300 μl des kompletten RPMI 1640-Mediums in die neue Vertiefung. Resuspendieren Sie den 96-Well-Klon, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, und übertragen Sie die Zellen in die neue Well, wobei Sie sie homogen verteilen. Fügen Sie bei Bedarf neue Medien hinzu.
   1. Wenn die Vertiefungen der 24-Well-Platte mit Zellen gefüllt sind (ca. 5 x 10⁶ Zellen), in eine flache Vertiefung einer 6-Well-Platte umfüllen. Geben Sie 2 ml des kompletten RPMI 1640-Mediums in die neue Vertiefung. Resuspendieren Sie die Zellen in der 24-Well-Platte, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren, und verteilen Sie sie homogen in der neuen Vertiefung.
10. Fügen Sie bei Bedarf Medien hinzu. Wenn die Zellen nicht in Kultur aufbewahrt werden sollen, pelletieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min bei RT. Lagern Sie die Überstände für die ELISA-Untersuchung. Waschen Sie das Pellet der Zellen einmal mit 1 x PBS, zentrifugieren Sie erneut bei 400 x g für 5 min und lagern Sie es trocken bei -80 °C bis zur RNA-Extraktion.
    1. Wenn die Zellen in der 6-Well-Platte konfluent werden (ca. 20 x 10⁶ Zellen), auf eine 60-mm-Kulturplatte übertragen. Geben Sie 4 ml des vollständigen RPMI 1640-Mediums auf die neue Platte. Resuspendieren Sie die Zellen in einer 6-Well-Platte und übertragen Sie sie wie in den Schritten 5.9 und 5.10 ausgeführt.
11. Fügen Sie bei Bedarf neue Medien hinzu. In diesem Schritt frieren Sie die Zellen bei 10 – 30 Millionen/ml in 90 % fötalem Kälberserum und 10 % DMSO ein. Wenn größere Mengen an Zellen benötigt werden, setzen Sie die Expansion der Klone in größeren Oberflächenplatten fort.

>6. ELISA für den Nachweis von IgG-Antikörpern

1. 50 μl/Well in einer ELISA-Platte mit Ziegen-F(ab)2-Anti-Fc-Antikörper, verdünnt 1 200 in Beschichtungspuffer, abgeben. Der Beschichtungspuffer enthält 50 mM Natriumcarbonat (Na2, CO₃), pH 9,6.
2. Verschließen Sie die Platten mit einem Plastikaufkleber und inkubieren Sie sie 1 Stunde bei 37 °C. Alternativ können Sie sie auch bei 4 °C O/N inkubieren.
3. Waschen Sie jede Mulde 6 Mal mit 200 μl Waschpuffer. Der Waschpuffer enthält 0,05 % Tween-20 in 1 x PBS. Berühren oder zerkratzen Sie nicht die Well-Oberfläche, an die sich der Antikörper gebunden hat.
4. Block mit Blockierungspuffer, 100 μl/Well. Der Blockierungspuffer enthält 4 % fettfreie Trockenmilch in PBS. Die Platte verschließen und 1 Stunde bei 37 °C inkubieren.
5. Nicht waschen. Entsorgen Sie den Blockierpuffer und schlagen Sie die Platte 3 Mal kopfüber auf ein Papiertuch, um die Restflüssigkeit zu entfernen.
6. Inkubieren Sie die Überstände und Standards von Klonen.
   1. Für einen ersten Test werden die in Schritt 5.6 oder 5.7 1/3 erhaltenen Klonüberstände in RPMI verdünnt. Für die Standards verdünnen Sie mit RPMI-Medium humane IgG-Lösung, um Folgendes zu erhalten: 1.000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,6 ng/ml und Leergewicht. 50 μl/Vertiefung verwenden und 60 min bei 37 °C inkubieren. Analysieren Sie weitere Verdünnungen des Überstands des Klons, um die Antikörperaffinität zu testen, z. B. 1/10 oder 1/100.
7. Waschen wie in Schritt 6.3 gemacht.
8. Verwenden Sie 50 μl/Vertiefung Ziegen-F(ab)2-Anti-Human-IgG-Fc-Peroxidase, konjugiert, verdünnt 1:20.000 im Inkubationspuffer. Der Inkubationspuffer enthält 1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02 % Tween 20 in 1x PBS. Bei 37 °C 60 min inkubieren.
9. Waschen wie in Schritt 6.3 gemacht.
10. 100 μl/Vertiefung Substratlösung mit 0,1 % 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) zugeben. 10 Minuten inkubieren, bis sich in den Vertiefungen eine stabile blaue Farbe bildet. Sei vorsichtig; Warten Sie nicht zu lange!
11. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 2 M Schwefelsäure (H₂SO₄). Messen Sie die Resorption bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der Reaktion.
    HINWEIS: Alle Überstände der Klone mit 3 Standardabweichungen über dem Blindwert werden als positiv für humane IgG-Antikörper angesehen. Zur Bestätigung der positiven Klone sollte dieser ELISA mindestens dreimal in verschiedenen Überständen desselben Klons wiederholt werden. Es wird auch empfohlen, die Möglichkeit einer unspezifischen Kreuzreaktivität auszuschließen, um sicherzustellen, dass es kein Signal gibt, wenn Überstände in unbeschichteten, aber verstopften Vertiefungen inkubiert werden. In diesem Schritt kann ein Nachweisassay zum Screening der antigenen Spezifität der interessierenden Antikörper durchgeführt werden, bevor mit Abschnitt 7 fortgefahren wird.

>7. RNA-Isolierung und Synthese der komplementären DNA (cDNA) des ersten Strangs der produzierenden IgG-Klone

1. Sobald die Produktion von IgG durch ELISA bestätigt ist, extrahieren Sie die RNA des Klons.
2. Für die Extraktion von RNA aus Zellen, die in den Schritten 5.7 oder 5.9 wachsen, verwenden Sie das superscript III cells direct cDNA-Synthesekit, mit dem DNA von 10.000 Zellen in eine Zelle gewonnen werden kann.
3. Für die Extraktion von RNA aus größeren Zellmengen oder aus dem in Schritt 5.11 gelagerten Pellet verwenden Sie das hochreine RNA-Isolationskit. Auch andere Systeme der RNA-Extraktion können für diesen Schritt geeignet sein. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
4. Für Zellnummern zwischen 1 x 10⁶ und 1 x 10⁴ verwenden Sie das reverse Transkriptionssystem gemäß den Anweisungen des Herstellers. Andere Systeme für die Erststrang-cDNA-Synthese können ebenfalls verwendet werden.

>8. 1. und 2. PCR zur Amplifikation der schweren und leichten Ketten der IgG-produzierenden B-Zell-Klone

1. Mit der cDNA der Zellklone, die in den Schritten 5.6 und 5.7 gewonnen und in Schritt 6 im IgG-ELISA positiv ist, wird die PCR mit den in Tabelle 1 aufgeführten Primern durchgeführt.
2. Richten Sie unabhängige PCRs für jede IgG-Heavy-, Kappa- und Lambda-Kette ein. Stellen Sie eine Stammlösung mit Vorwärts- und Rückwärtsprimern in gleichen Konzentrationen her. Geben Sie sie in einer Endkonzentration von 0,4 μM in die Reaktion ein.
3. Verwenden Sie 1 μl der cDNA-Synthese, um die 1^ST PCR durchzuführen. Führen Sie hier 20-μl-Reaktionen gemäß den Anweisungen des Takara Taq-Herstellers durch. Alternativ können Sie auch andere Polymerasen verwenden.
4. Platzieren Sie die 1^. PCR unter den folgenden Zyklusbedingungen: 94 °C für 5 Minuten; (50 Zyklen mit: 94 °C für 30 Sekunden; 58 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 45 Sekunden; 72 °C für 7 Minuten; auf 4 °C abkühlen lassen.Nehmen Sie einen Rohling in die Reaktion auf, um mögliche Verunreinigungen zu erkennen.
5. 1x TBE (89 mM Trisborat und 2 mM EDTA) vorbereiten. In einem Volumen von 100 ml 1x FSME 1 g Agarose (1% Agarosegel) zugeben. Die Lösung in der Mikrowelle ca. 1 Minute erhitzen, bis sich die Agarose aufgelöst hat. Dann 4 μl 10 mg/ml Ethidiumbromid (oder einen gleichwertigen DNA-Farbstoff) zugeben und mischen.
   1. Gießen Sie den Inhalt in eine Schale und warten Sie, bis er polymerisiert ist. Lassen Sie 5 μl des PCR-Mixes in das Gel geben, um die Banden zu visualisieren. Schwere Kettenfragmente sollten etwa 400 - 550 bp betragen, während leichte Kettenfragmente etwa 300 - 400 bp betragen sollten. Wenn die Banden nicht nachgewiesen werden, fahren Sie ebenfalls mit der 2^. PCR fort.
6. Verwenden Sie 1 μl der ersten PCR-Mischung, um die 2^. PCR durchzuführen. Verwenden Sie die gleichen Reagenzien wie in Schritt 8.2, jedoch mit der geeigneten Mischung von Primern (siehe Tabelle 1). Für die 2^. PCR sind folgende Bedingungen zu verwenden: 94 °C für 5 min; (50 Zyklen mit: 94 °C für 30 Sekunden; 56,5 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 55 Sekunden); 72 °C für 7 min; Lassen Sie es auf 4 °C abkühlen. Nehmen Sie einen Rohling in die Reaktion auf, um mögliche PCR-Kontaminationen zu erkennen.
7. Bereiten Sie ein Agarose-Gel vor, wie in 8.5 beschrieben. Führen Sie das Gel aus, um das PCR-Produkt wie in 8.5.1 zu visualisieren. Verwenden Sie die Amplifikationen, die die Fragmente der richtigen Größe für die Klonierung in Schritt 9 enthalten, und stellen Sie die Antikörper in Schritt 10 her.
8. Sequenzieren Sie die DNA, indem Sie 10 μl Reaktion verwenden, die Folgendes enthält: 100 ng der 2^. PCR, 0,2 μM des Primers oder Primer-Mixes, 1 μl des Terminators und 1 μl des Puffers. Die Sequenzierungsreaktion wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: (25 Zyklen mit: 96 °C für 10 Sekunden; 50 °C für 5 Sekunden; und bis 60 ΰC für 4 Minuten); 60 °C für 7 min; Auf 4 °C abkühlen lassen.
9. Reinigen Sie die Sequenzierungsreaktionen mit Microspin G50-Säulen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Werten Sie die Sequenzen der Ligation in einem automatischen Sequenzanalysator aus, wie zuvor beschrieben. Die Elektropherogramme sollten sauber sein und einer einzigen Immunglobulinsequenz entsprechen.
   HINWEIS: Wenn die PCR-Produkte unklare oder gemischte Immunglobulinsequenzen aufweisen, erwägen Sie bitte, sie mit dem TopoTA-System zu klonen, um isolierte Sequenzen zu erhalten, und fahren Sie dann mit Schritt 9 fort.

>9. Klonierung und Sequenzierung der schweren und leichten Ketten der produzierenden IgG-Klone

1. Bereiten Sie 1 μg DNA der Vektoren pFUSE2ss-CLIg-hk, pFUSE2ss-CLIg-hl2 und pFUSEss-CHIg-hG1 vor.
2. Verdauen Sie diese Vektoren mit den entsprechenden Restriktionsenzymen. Verwenden Sie EcoRI und BsiWI für pFUSE2ss-CLIg-hk, EcoRI und AvrII für pFUSE2ss-CLIg-hl2 und EcoRI und NheI für pFUSEss-CHIg-hG1. Verwenden Sie 3 Einheiten jedes Restriktionsenzyms für 1 μg DNA des Vektors.
   1. Verdauen Sie mit einem Enzym und reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit. Mit dem zweiten Enzym verdauen und mit einem Gel-Extraktionskit reinigen (gemäß dem Protokoll des Herstellers). Schneiden Sie das interessierende Fragment aus dem Agarose-Gel ab. Bereiten Sie das Agarose-Gel wie in Schritt 8.5 vor.
3. Verdauen Sie die 2^. PCR-Produkte des produzierenden IgG-Klons: EcoRI und BsiWI für die Kappa-Kettenamplifikation, EcoRI und AvrII für die Lambda-Kettenamplifikation und EcoRI und NheI für die Schwerkettenamplifikation. Verdauen Sie mit einem Enzym und reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit. Verdauen Sie mit dem zweiten Enzym und reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem PCR-Aufreinigungskit. Verwenden Sie die gleichen Einheiten von Enzymen und DNA-Mengen wie in Schritt 9.2.
4. Ligattieren Sie die PCR-Fragmente im Inneren der Vektoren mit T4-DNA-Ligase 16 °C O/N gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Das verwendete Verhältnis sollte 1 : 2 betragen (Vektor : Einfügen).
5. Verwenden Sie 1 μl der Ligation, um DH5α-Bakterien zu transformieren. Befolgen Sie die Bedingungen des DH5α-Herstellers für die Umwandlung. Verteilen Sie Bakterien in Blasticidin- oder Zeocinplatten, je nach Art des verwendeten Vektors. Die Platten O/N bei 37 °C inkubieren.
6. Züchten Sie einzelne Kolonien und extrahieren Sie DNA mit einem Miniprep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie für den Anbau einzelner Kolonien und die DNA-Extraktion die Empfehlungen des Herstellers, Empfehlungen aus dem DNA-Miniprep-Kit. Analysieren Sie sie durch Verdau mit den Enzymen, die zur Herstellung von Vektoren und Inserts verwendet werden, wie in den Schritten 9.2 und 9.3.
7. Sequenzieren Sie die DNA, indem Sie 100 ng des Vektors verwenden, wie in den Schritten 8.8 und 8.9 beschrieben.

10. Produktion von Antikörpern in HEK-Zellen

1. Züchten Sie HEK-Zellen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum, 1 % L-Glukose, 1 % Penicillin/Streptavidin (DMEM+), bis zu einer Konfluenz von 75 % in einer 150-mm-Zellkulturplatte. Führen Sie die Haubenstufe 10.1 bis 10.7 durch.
2. Tauschen Sie vor der Transfektion das Medium auf das Medium wie zuvor, jedoch ohne fötales Kälberserum.
3. Bereiten Sie für jede Transfektion mit schweren, leichten Ketten eine Transfektionsmischung mit 2,5 ml DMEM (ohne Serum), 9 μg des Vektors mit der schweren Kette, 6 μg des Vektors mit der Leichtkette und 100 μl Polyethylenimin (PEI)-Lösung (aus einem Stamm von 1 μg/μl) vor. 15 Minuten bei RT inkubieren.
4. 2,5 ml der in Schritt 10.3 hergestellten Transfektionsmischung vorsichtig zu den HEK-Zellen in der Platte geben. Schütteln Sie die Platte, um sie gleichmäßig zu verteilen.
5. Inkubieren Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C mit 5 % CO₂ für 24 h.
6. Wechseln Sie das Nährmedium auf Medium ohne fötales Kälberserum.
7. Sammeln Sie das Medium 4 Tage später von den Platten.
   HINWEIS: Die Antikörper in den Medien können verwendet werden, um ihre Reaktivität in vitro und in vivo zu charakterisieren.

Tabelle 1. Verwendete Grundierungen.

1st PCR-Primer
	Vorwärts (5'-3')	Rückwärts (3'-5')
IgG	5′ L-VH 1 ACAGGTGCCCACTCCCAGGTGCAG	3′ Cγ CH1 GGAAGGTGTGCACGCCGCTGGTC
	5′ L-VH 3 AAGGTGTCCAGTGTGARGTGCAG
	5′ L-VH 4/6 CCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAG
	5′ L-VH 5 CAAGGAGTCTGTTCCGAGGTGCAG
κ	5′ L Vκ 1/2 ATGAGGSTCCCYGCTCAGCTGCTGG	3′ Cκ 543 GTTTCTCGTAGTCTGCTTTTTGCTCA
	5′ L Vκ 3 CTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAG	3′ Cκ 494 GTGCTGTCCTTGCTGTCCTGCT
	5′ L Vκ 4 ATTTCTCTGTTGCTCTGGATCTCTCTG
	5′ Pan Vκ ATGACCCAGWCTCCABYCWCCCTG
λ	5′ L Vλ 1 GGTCCTGGGCCCAGTCTGTGCTG	3′ Cλ CACCAGTGTGGCCTTGTTGGCTTG
	5′ L Vλ 2 GGTCCTGGGCCCAGTCTGCCCTG
	5′ L Vλ 3 GCTCTGTGACCTCCTATGAGCTG
	5′ L Vλ 4/5 GGTCTCTCTCSCAGCYTGTGCTG
	5′ L Vλ 6 GTTCTTGGGCCAATTTTATGCTG
	5′ L Vλ 7 GGTCCAATTCYCAGGCTGTGGTG
	5′ L Vλ 8 GAGTGGATTCTCAGACTGTGGTG
2. PCR-Primer
	Vorwärts (5'-3')	Rückwärts (3'-5')
IgH	5′ EcoRI VH1 CAACCGGAATTCGCAGGTGCAGCTGG TGCAG	3′ NheI JH 1,2,4,5 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGAGGGT GACCAG
	5′ EcoRI VH1 bis 5 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGCAG	3′ NheI JH 3 CTGCTAGCTAGCTGAGAGACGGTGA CCATTG
	5′ EcoRI VH3 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCTG GTGGAG	3′ NheI JH 6 CTGCTAGCTAGCTGAGGAGACGGTG ACCGTG (ACCGTG)
	5′ EcoRI VH3 23 CAACCGGAATTCAGAGGTGCAGCT GTTGGAG
	5′ EcoRI VH4 CAACCGGAATTCAGGTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 4 34 CAACCGGAATTCACAGGTGCAGCTAC AGCAGTG
	5′ EcoRI VH 1 18 CTTCCGGAATTCAGGTTCAGCT GGTGCAG
	5′ EcoRI VH 1 24 CTTCCGGAATTCACAGGTCCAGCT GGTACAG
	5′ EcoRI VH3 33 CTTCCGGAATTCAGGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRIVH 3 9 GATCCGGAATTCAGAAGTGCAGCT GGTGGAG
	5′ EcoRI VH4 39 GATCCGGAATTCAGCTGCAGCT GCAGGAG
	5′ EcoRI VH 6 1 GATCCGGAATTCAGGTACAGCT GCAGCAG
κ	5′ EcoRI Vκ 1 5 CAACCGGAATTCAGACATCCAGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 1 bis 4 GCCACCGTACGTTTTTGATYTCCACCTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1 9 CTTCCGGAATTCACATCCAGTTGAC CCAGTCT	3′ BsiWI Jκ 2 GCCACCGTACGTTTGATCTCCAG CTTGGTC
	5′ EcoR1 Vκ 1D 43 CTTGGCGAATTCAGCCATCCGGATGA CCCAGTC	3′ BsiWI Jκ 3 GCCACCGTACGTTTGATATCCACT TTGGTC (Englisch)
	5′ EcoR1 Vκ 2 24 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATGA CCCAGAC
	5′ EcoR1 Vκ 2 28 CTTCCGGAATTCAGATATTGTGATG ACTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 2 30 CTTCCGGAATTCAGATGTGTGTGATGA CTCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 11 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTG ACACAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 15 CTTCCGGAATTCAGAAATAGTGATG ACGCAGTC
	5′ EcoR1 Vκ 3 20 CTTCCGGAATTCAGAAATTGTGTTGA CGCAGTCT
	5′ EcoR1 Vκ 4 1 CTTCCGGAATTCAGACATCGTGATG ACCCAGTC
λ	5′ EcoR1 Vλ 1 CTTCCGGAATTCAGTCTGTGCT GACKCAG	3′ AvrII Jλ 1 bis 3 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTSACCT TGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 2 CTTCCGGAATTCAGTCTGCCC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 4 CTGGTTACCTAGGAAAATGATCAGC TGGGTTCC
	5′ EcoR1 Vλ 3 CTTCCGGAATTCATCCTATGAGC TGACWCAG	3′ AvrII Jλ 5 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGC TCGGTCCC
	5′ EcoR1 Vλ 4 bis 5 CTTCCGGAATTCAGCYTGTG CTGACTCA	3′ AvrII Jλ 6 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAGCT GGGTGCC
	5′ EcoR1 Vλ 6 CTTCCGGAATTCAAATTTTATGC TGACTCAG	3′ AvrII Jλ 7 CTGGTTACCTAGGAGGACGGTCAC TTGGTCCAT
	5′ EcoR1 Vλ 7 bis 8 CTTCCGGAATTCAGRCTGTG GTGACYCAG

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 10771	Lösung, die Polysaccharose und Natriumdiatrizoat enthält
FACSAria II Zellsortierer	BD Biowissenschaften
96 Mikrotiterplatten mit U-Boden	Costar	3799
Advanced Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mittel	Gibco, Lebenstechnologien	Artikel-Nr.: 12633-020
30 % v/v EBV-haltiger Überstand der B95-8-Zelllinie	ATCC	CRL-1612	3,4 x 108 Kopien/ml
CpG2006	Invivogen	ODN 7909
Wi38-Zellen	Sigma-Aldrich	90020107
Interleukin-2	Roche	10799068001
ELISA-Platten	Greiner Bio-One, Microlon	655092
AffiniPure F(ab')2 Fragment Ziege Anti-Human-IgG, Fcγ Fragment spezifisch (unkonjugiert)	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 109-006-008
4% fettfreie Trockenmilch (Blotting Grade Blocker)	Biorad	Tel.: 170-6404
Menschliches IgG	Sigma	I 2511	HUMAN IgG-gereinigtes Immunglobulin, 5,6 mg/ml
Ziege F(ab)2 antihumanes IgG Fcγ (konjugiert mit Peroxidase (PO))	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 109-036-008
ELISA-Lesegerät (Perkin Elmer 2030)	Perkin Elmer	Artikel-Nr.: 2030-0050
Peroxidase-konjugiertes AffiniPure Kaninchen Anti-Human-IgM, Fc5μ	Jackson Immunforschung	Artikel-Nr.: 309-035-095
SuperScript III Zellen Direktes cDNA-Synthesesystem	Invitrogen	Nr. 18080-200
Angewandte Biosysteme (ABI) GeneAm PCR-System 2700	Angewandte Biosysteme
Hochreines RNA-Isolationskit	Roche	11828665001
Kit für das reverse Transkriptionssystem	Promega	A3500
Rekombinante Taq-DNA-Polymerase	Takara	R001A
Grundierungen (2μl)	Sigma
Ultrareine Agarose	Invitrogen	16500-500
100 bp Leiter	Invitrogen	Artikel-Nr.: 15628-019
Menge Eins 4.5.2 (Gel Doc 2000)	Biorad	Tel.: 170-8100
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	QIAGEN	Artikel-Nr.: 28106
BigDye Terminator v3.1 Zyklus-Sequenzierungskit	Angewandte Biosysteme	4337455
0,1 ml Reaktionsplatte (MicroAMP Optical 96-Well)	Angewandte Biosysteme	4346906
Gen-Analysegerät ABI300	Angewandte Biosysteme	4346906
DH5α kompetente Zellen (E. coli)	Invitrogen	Nr. 18263-012
pFUSEss-CHIg-hG1 (4493 bp)	Invivogen	Pfusess-HCHG1
pFUSEss-CHIg-hG4 (4484 bp)	Invivogen	PFUSESS-HCHG4
pFUSE2ss-CLIg-hk (3875 bp)	Invivogen	pfuse2ss-hclk
pFUSE2ss-CLIg-hl2 (3883 bp)	Invivogen	PFUSE2SS-HCLL2
SOC-Mittel	Invitrogen	Artikel-Nr.: 15544-034
LB-basiertes Agar-Medium, ergänzt mit Zeocin (Fast-Media Zeo Agar)	Invivogen	fas-zn-s
Flüssiges Medium auf Bouilloni-Basis (TB), ergänzt mit Zeocin (Fast-Media Zeo TB)	Invivogen	fas-zn-l
DNA-Miniprep-Kit	Omega Bio Technologie	Nr. D6942-02
Nanodrop (ND1000 Spektralphotometer)	Nanotropfen
LB-basiertes Agar-Medium, ergänzt mit Blasticidin (Fast-Media Blast Agar)	Invivogen	fas-bl-s
Flüssiges Medium auf Bouillon-Basis (TB), ergänzt mit Blasticidin (Fast-Media Blast TB)	Invivogen	fas-bl-l
EcoRI	Neuengland Biolabore	R0101S	20.000 U/ml, in 10x NEBuffer EcoRI
NheI	Neuengland Biolabore	R0131S	10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 2.1
2-Log-DNA-Leiter	Neuengland Biolabore	N3200S	0,1-10,0 kB, 1.000 μg/ml
Weihnachten	Neuengland Biolabore	R0180S	10.000 U/ml, in 10x CutSmart Puffer
BsiWI	Neuengland Biolabore	R0553S	10.000 U/ml, in 10x NEBuffer 3.1
AvrII	Neuengland Biolabore	R0174S	5.000 U/ml, in 10x CutSmart Puffer
FastAP Thermosensitive alkalische Phosphatase	Thermo Scientific	EF0651	1 U/μL, in 10x FastAP Puffer
DH5α kompetente Zellen	Invitrogen	Nr. 18263-012
PE Maus Anti-Human-IgG	BD Pharmingen	555787
anti-CD22, PerCP-Cy5.5, Klon: HIB22	Fischer wissenschaftlich	BDB563942
QIAprep Spin Miniprep Bausatz	QIAGEN	Artikel-Nr.: 27106
BigDye Terminator v3.1	Angewandte Biosysteme	4337455

kg kg