Eine Hybridom-Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen eine Metallopeptidase

Zusammenfassung

Quelle: Xia, P., et al. Produktion von monoklonalen Antikörpern, die auf die Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel von Schweinen abzielen. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt einen Assay zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen die porzine Aminopeptidase N (APN), eine membrangebundene Metallopeptidase, unter Verwendung einer traditionellen Hybridomtechnologie. Bei der Immunisierung einer Maus mit APN werden die Milzzellen geerntet und mit unsterblichen Myelomzellen fusioniert, um Hybridome zu erzeugen. Die Hybridome werden dann unter Verwendung des HAT-Mediums (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) selektiert und proliferiert, um monoklonale Antikörper herzustellen, die für verschiedene APN-Epitope spezifisch sind.

Protokoll

Alle Tiermodellverfahren wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem JoVE Veterinärprüfungsausschuss überprüft.

>1. Immunisierung von Tieren

1. Subkutan (s.c.) injizieren weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen alle 2 Wochen mit 50 μg APN-Protein oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Negativkontrolle), gemischt mit Adjuvantien. Verwenden Sie ein vollständiges Freund-Adjuvans, das die hitzeabgetöteten Mykobakterien enthält, für die Erstimmunisierung und ein unvollständiges Freund-Adjuvans für Auffrischungsimpfungen. Mischen Sie gleiche Volumina des APN-Proteins (oder PBS) und des Freund-Adjuvans bzw. des unvollständigen Freund-Adjuvans.
2. Nachweis von Antikörpertitern gegen APN in den Seren dieser Mäuse mittels indirektem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, verdünnt in 0,05 M PBS (pH 9,6).

2. Hybridom-Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen APN

1. Intraperitoneal (i.p.) injizieren Sie 100 μg APN-Protein in die ausgewählten Mäuse für einen abschließenden Antigen-Boost.
2. Drei Tage später euthanasieren Sie die Mäuse mit Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) und Zervixluxation.
3. Sammeln Sie Milz und waschen Sie sich zweimal mit DMEM, um Blut- und Fettzellen zu entfernen. Filtrieren Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Maschen-Kupfergitter, um Gewebeablagerungen zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen durch Zentrifugation (1500 × g, 10 min), um die Milzmembran zu entfernen.
4. Myelom-SP2/0-Zellen der Maus in einem 25 cm² Kolben mit 5 ml modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco aussäen, ergänzt mit 6 % fötalem Rinderserum (FBS) und Kultur bei 37 °C, 6 % CO₂ -Atmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach 5-6 Tagen Kultur erreichen die Zellen nach der Wiederbelebung eine Konfluenz von 80 % bis 90 % und befinden sich in der Wachstumslog-Phase. Unter dem Mikroskop sind die Zellen rund, hell und klar.
5. Einen Tag vor der Hybridisierung werden Makrophagen aus den Peritonealhöhlen der Mäuse nach einer zuvor veröffentlichten Methode entnommen.
6. Peritonealmakrophagen mit einer Dichte von 0,1 bis 0,2 × 10⁵/ml in 96-Well-Platten säen, wobei jede Vertiefung 100 μl HAT-Medium enthält (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1x HAT-Supplement) und über Nacht bei 37 °C und 6 % CO₂ -befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
7. Für die Hybridisierung werden SP2/0-Zellen vorsichtig mit einer Pipette von 8-10 Flaschen aspiriert und in 10 ml serumfreiem DMEM-Medium suspendiert. Waschen Sie die Zellen mit frischem DMEM, zentrifugieren Sie zweimal (1500 × g, 10 min) und suspendieren Sie sie dann erneut in 10 mL DMEM.
8. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SP2/0-Zellen im Verhältnis 10:1 und überführen Sie sie in 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren (1500 × g, 10 min) und den Überstand verwerfen. Sammeln Sie die Zellpellets am Boden der Röhrchen und klopfen Sie mit der Handfläche, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen.
9. 1 ml Polyethylenglykol 1500 (PEG 1500), vorgewärmt auf 37 °C, tropfenweise mit einer Pipette über einen Zeitraum von 45 s auf das gelöste Zellpellet geben, dabei den Boden des Röhrchens vorsichtig drehen.
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10. ml auf 37 °C vorgewärmtes DMEM über einen Zeitraum von 90 s langsam zu der obigen Mischung geben, gefolgt von weiteren 30 mL frischem DMEM. Legen Sie das Schmelzrohr für 30 min in ein 37 °C heißes Wasserbad.
11. Nach der Inkubation im warmen Bad werden die Zellen geerntet und in HAT-Medium wieder suspendiert. Dann in einer 96-Well-Platte kultivieren, die mit Peritonealmakrophagen geimpft wurde.
12. Fünf Tage später fügen Sie 100 μl frisches HAT-Medium in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte weitere 5 Tage, danach ersetzen Sie das Medium durch HT-Medium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1x HT-Ergänzung).
13. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, verdünnt in 0,05 M PBS (pH 9,6), um monoklonale Antikörper im Hybridom-Überstand mittels ELISA-Assay zu analysieren.
    1. Wenn das Medium in den Vertiefungen der 96-Well-Platte gelb wird (aufgrund des Zellwachstums und der Freisetzung von Metaboliten, sinkt der pH-Wert des Mediums auf 6,8 und das Phenolrot wechselt von fuchsia zu gelb) oder Zellcluster beobachtet werden, nehmen Sie 100 μl Überstand aus den ausgewählten Vertiefungen auf und geben Sie ihn in die Vertiefungen der beschichteten ELISA-Platte. Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die OD_450-Werte zu messen.
    2. Verwenden Sie die polyklonalen Antikörper gegen APN und nicht infiziertes Mausserum als Positiv- bzw. Negativkontrolle und verwenden Sie PBS als Blindkontrolle. In dieser Studie wurde das Verhältnis von Probe zu Negativkontrolle (P/N) von OD₄₅₀ ≥ 2,1 als Positivselektionsstandard anerkannt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5881	Immunisierung von Tieren
DMEM	Gibco	11965092	Zellkultur
DMEM-F12	Gibco	12634010	Zellkultur
Erweitertes Zellzähl-Kit-8	Beyotime Biotechnologie	Nr. C0042	Messung der Lebensfähigkeit und Vitalität der Zellen
Fötales Rinderserum	Gibco	Nr. 10091	Zellkultur
Geneticin™ selektives Antibiotikum	Gibco	11811098	Selektives Antibiotikum
HAT-Zuschlag (50X)	Gibco	21060017	Auswahl der Zellen
HT-Zuschlag (100X)	Gibco	11067030	Auswahl der Zellen
Unvollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5506	Immunisierung von Tieren
Mikroplatten-Reader	BioTek	KASTEN 998	ELISA-Analyse
Polyethylenglykol 1500	Roche Diagnostik	10783641001	Zellfusion
96-Well-Mikroplatte	Corning	Artikel-Nr.: 3599	Zellkultur