Ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Antikörper gegen Metallopeptidase

Zusammenfassung

Quelle: Xia, P. et al., Produktion von monoklonalen Antikörpern, die auf die Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel von Schweinen abzielen.J. Vis. Exp.(2021)

Dieses Video zeigt ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern gegen Metallopeptidase. Rekombinante Plasmide, die Gene für den Antikörper, das grün fluoreszierende Protein und die Antibiotikaresistenz tragen, werden mit Lipofectamin in Epithelzellen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden selektiert und kultiviert, um rekombinante Antikörper zu erzeugen.

Protokoll

>1. Herstellung des porzinen Aminopeptidase N (APN)-Proteinantigens

HINWEIS: Der Stamm pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) und die APN-stabil exprimierten Zellen pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 wurden in einer früheren Studie konstruiert.

1. Gewinnen Sie Bakterien aus einem gefrorenen Glycerinvorrat und streichen Sie sie auf Luria-Bertani (LB)-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin (Km⁺) für die Isolierung einer einzelnen Kolonie.
2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie aus der frisch gestreiften Platte, kultivieren Sie sie in 4 mL LB-Medium (10 g/l Trypton, 10 g/l Natriumchlorid (NaCl) und 5 g/l Hefeextrakt, pH 7,2), ergänzt mit Km⁺ (50 μg/ml), und lassen Sie sie über Nacht (12-16 h) unter Rühren (178 U/min) bei 37 °C wachsen.
3. Die vorbereiteten Bakterien bei 1:100 in frischer Km⁺ LB-Brühe verdünnen und bei 37 °C unter Schütteln 2-3 h inkubieren, bis der OD₆₀₀ 0,4-0,6 erreicht.
4. Geben Sie Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM in das Medium und inkubieren Sie die Kulturen für weitere 10 Stunden bei 16 °C.
5. Zentrifugieren und ernten Sie die Bakterien daher mittels IPTG-Induktion (10.000 × g, 4 °C 15 min).
6. Resuspendieren Sie das Zellpellet mit 5 mL LEW (Lysis/Equilibration/Wash) Puffer (50 mM wasserfreies Natriumphosphat monobasisch (NaH₂PO₄) und 300 mM NaCl, pH 8,0) mit 1 mg/ml Lysozym. Die Bakteriensuspension wird 30 min lang auf Eis gerührt und mit einem Ultraschall-Homogenisator vollständig beschallt (15 s Puls und 20 s aus, 15 min).
7. Zentrifugieren Sie das Rohzelllysat bei 4 °C und 10.000 × g für 30 Minuten, um Zelltrümmer zu entfernen. Überstand in eine voräquilibrierte Säule überführen und 1-2 min vor der Schwerkraftdrainage inkubieren. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal.
8. Waschen Sie die Säule mit 20 ml LEW-Puffer und entleeren Sie sie mit der Schwerkraft. Eluieren Sie das Histidin-markierte APN-Protein mit 9 mL Elutionspuffer (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl und 250 mM Imidazol, pH 8,0) und sammeln Sie es in Dialyseschläuchen.
9. Dialysieren Sie die Proteinlösung über Nacht bei 4 °C in Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 135 mM NaCl, 4,7 mM Kaliumchlorid, 2 mM NaH₂PO₄ und 10 mM Dodecahydrat-Natriumphosphat zweibasisch, pH 7,2).
10. Analysieren Sie mit einem 12,0 % SDS-PAGE-Gel und Western Blotting, um die Reinheit des APN-Proteins zu beurteilen.
    1. Laden Sie 5 μg Protein in jede Vertiefung des Gels und lassen Sie es 1,5 h lang bei 110 V laufen. Übertragen Sie dann das Protein 50 Minuten lang bei 15 V auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran. Bestimmen Sie die Konzentration des gereinigten Proteins mit einem Bicinchoninsäure (BCA)-Assay.

>2. Immunisierung von Tieren

1. Subkutan (s.c.) injizieren weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen mit 50 μg APN-Protein oder PBS (Negativkontrolle), gemischt mit Adjuvantien einmal alle 2 Wochen. Verwenden Sie ein vollständiges Freund-Adjuvans, das die hitzeabgetöteten Mykobakterien enthält, für die Erstimmunisierung und ein unvollständiges Freund-Adjuvans für Auffrischungsimpfungen. Mischen Sie gleiche Volumina des APN-Proteins (oder PBS) und des Freund-Adjuvans bzw. des unvollständigen Freund-Adjuvans.
2. Nachweis von Antikörpertitern gegen APN in den Seren dieser Mäuse mittels indirektem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung einer Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, verdünnt in 0,05 M PBS (pH 9,6).

>3. Hybridom-Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gegen APN

1. Intraperitoneal (i.p.) injizieren Sie 100 μg APN-Protein in die ausgewählten Mäuse für einen abschließenden Antigen-Boost.
2. Drei Tage später euthanasieren Sie die Mäuse mit Pentobarbital-Natrium (50 mg/kg, v/v, intraperitoneal) und Zervixluxation.
3. Milz sammeln und zweimal mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) waschen, um Blut- und Fettzellen zu entfernen. Filtrieren Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Maschen-Kupfergitter, um Gewebeablagerungen zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen durch Zentrifugation (1500 × g, 10 min), um die Milzmembran zu entfernen.
4. Myelom-SP2/0-Zellen der Maus in einem 25 cm² Kolben mit 5 ml DMEM säen, ergänzt mit 6 % fötalem Rinderserum (FBS) und Kultur bei 37 °C, 6 % Kohlendioxid (_{CO 2}) Atmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach 5-6 Tagen Kultur erreichen die Zellen nach der Wiederbelebung eine Konfluenz von 80 % bis 90 % und befinden sich in der Wachstumslog-Phase. Unter dem Mikroskop sind die Zellen rund, hell und klar.
5. Einen Tag vor der Hybridisierung werden Makrophagen aus den Peritonealhöhlen der Mäuse nach einer zuvor veröffentlichten Methode entnommen.
6. Peritonealmakrophagen mit einer Dichte von 0,1 bis 0,2 × 10⁵/ml in 96-Well-Platten säen, die jeweils 100 μl Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT)-Medium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1x HAT-Supplement) enthalten, und über Nacht bei 37 °C und 6 % CO₂ -befeuchteter Atmosphäre inkubieren.
7. Für die Hybridisierung werden SP2/0-Zellen vorsichtig mit einer Pipette von 8-10 Flaschen aspiriert und in 10 ml serumfreiem DMEM-Medium suspendiert. Waschen Sie die Zellen mit frischem DMEM, zentrifugieren Sie zweimal (1500 × g, 10 min) und suspendieren Sie sie dann erneut in 10 mL DMEM.
8. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SP2/0-Zellen im Verhältnis 10:1 und überführen Sie sie in 50-ml-Röhrchen. Zentrifugieren (1500 × g, 10 min) und den Überstand verwerfen. Sammeln Sie die Zellpellets am Boden der Röhrchen und klopfen Sie mit der Handfläche, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen.
9. 1 ml Polyethylenglykol 1500 (PEG 1500), vorgewärmt auf 37 °C, tropfenweise mit einer Pipette über einen Zeitraum von 45 s auf das gelöste Zellpellet geben, dabei den Boden des Röhrchens vorsichtig drehen.
1
10. ml auf 37 °C vorgewärmtes DMEM über einen Zeitraum von 90 s langsam zu der obigen Mischung geben, gefolgt von weiteren 30 mL frischem DMEM. Legen Sie das Schmelzrohr für 30 min in ein 37 °C heißes Wasserbad.
11. Nach der Inkubation im warmen Bad werden die Zellen geerntet und in HAT-Medium wieder suspendiert. Dann in einer 96-Well-Platte kultivieren, die mit Peritonealmakrophagen geimpft wurde.
12. Fünf Tage später fügen Sie 100 μl frisches HAT-Medium in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte weitere 5 Tage, danach ersetzen Sie das Medium durch HT-Medium (DMEM ergänzt mit 10 % FBS und 1x HT-Ergänzung).
13. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit 5 μg/ml APN-Protein beschichtet ist, verdünnt in 0,05 M PBS (pH 9,6), um monoklonale Antikörper im Hybridom-Überstand mittels ELISA-Assay zu analysieren.
    1. Wenn das Medium in den Vertiefungen der 96-Well-Platte gelb wird (aufgrund des Zellwachstums und der Freisetzung von Metaboliten, sinkt der pH-Wert des Mediums auf 6,8 und das Phenolrot wechselt von fuchsia zu gelb) oder Zellcluster beobachtet werden, nehmen Sie 100 μl Überstand aus den ausgewählten Vertiefungen auf und geben Sie ihn in die Vertiefungen der beschichteten ELISA-Platte. Verwenden Sie ein Mikroplatten-Reader, um die Werte für die optische Dichte 450 (OD450) zu messen.
    2. Verwenden Sie die polyklonalen Antikörper gegen APN und nicht infiziertes Mausserum als Positiv- bzw. Negativkontrolle und verwenden Sie PBS als Blindkontrolle. In dieser Studie wurde das OD450-Verhältnis von Probe zu Negativkontrolle (P/N) ≥ 2,1 als positiver Selektionsstandard anerkannt.
14. Nach drei aufeinanderfolgenden positiven Selektionsrunden wählen Sie das Hybridom aus, das ein erhöhtes serologisches Ansprechen gegen das APN-Protein zeigt, für einen Assay mit begrenzter Verdünnung.
    1. Bereiten Sie Peritonealmakrophagen und Saatgut in 96-Well-Platten vor, wie zuvor beschrieben.
    2. Suspendieren Sie Hybridomzellen in HT-Medium mit durchschnittlich 0,5 bis 2 Zellen pro Vertiefung und kultivieren Sie sie in einem 37 °C_heißen Inkubator mit 6 % CO 2. Wiederholen Sie diesen Schritt drei- bis viermal, bis die vom ELISA-Immunoassay angezeigte Positivrate 100 % erreicht.
15. Unter dem Druck des kontinuierlichen Einfrierens und Auftauens werden die positiven Hybridomzellen ausgewählt, die in der Lage sind, stabil Anti-APN-Antikörper zu sezernieren und sich normal zu vermehren.
    1. Verabreichen Sie jeder Maus eine einmalige i.p. Injektion von 0,3 ml Pristan (8-10 Wochen). 10 Tage nach Erhalt von Pristin injizieren Sie jeder Maus 2-5 x 10⁵ Hybridomzellen in 0,5 ml PBS (pH 7,2).
    2. Entnehmen Sie 8 bis 10 Tage nach der Injektion vorsichtig Bauchfellflüssigkeit aus der Bauchhöhle dieser Mäuse.
    3. Ernten Sie die Überstände durch Zentrifugation bei 5.000 × g für 15 min und reinigen Sie die Antikörper in den Überständen mit 33 % gesättigtem Ammoniumsulfat [(NH₄)₂SO₄]-Fällung und Protein-A-Agarose.

>4. Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen das APN-Protein

1. Bestimmen Sie den Immunglobulin-Subtyp der gesammelten mAbs mit einem SBA-Klonotypisierungssystem-HRP. Verwenden Sie SDS-PAGE und Western Blotting, um die Reinheit und Spezifität von mAb zu beurteilen.
2. Analysieren Sie die Spezifität des mAb-Epitops gegenüber dem APN-Protein mithilfe von ELISA. Der Additivitätswert (AV) ist das Verhältnis von_{OD mAbs (a+b)} zu (OD_mAbs-a+OD_mAbs-b), das verwendet wird, um zu bewerten, ob mAbs dieselbe antigene Stelle erkennen; OD_mAbs-a und OD_mAbs-b repräsentieren die OD450-Werte verschiedener monoklonaler Antikörper gegen APN allein, und OD_{mAbs (a+b)} stellen die OD450-Werte einer 1:1-Mischung aus zwei mAbs gegen APN dar.
   1. Bewerten Sie jede Probe mit mindestens vier Wiederholungen und wiederholen Sie das gesamte Experiment mindestens dreimal.

>5. Expression von rAbs gegen APN

1. Extraktion der Gesamt-RNA aus den oben genannten Hybridomzellen und Milz von APN-immunisierten Mäusen (z.B. TRIzol). Synthetisieren Sie komplementäre DNA (cDNA) mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
2. Amplifizieren Sie variable Regionen von mAbs mittels verschachtelter Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und bestimmen Sie Schwerketten- (VH) und Leichtkettensequenzen (VL) mittels Sequenzierung. Analysieren Sie die Gene, die für VH und VL kodieren, mit dem IMGT-Mausgenomanalysetool (http://www.imgt.org/about/immunoinformatics.php).
3. Kombinieren Sie die VH- und VL-Gene mit Leader-Sequenzen und subklonieren Sie sie sequentiell in die Vektoren pET28a (+) bzw. pIRES2-ZsGreen1, wobei Sie die nahtlose Klonierungstechnologie verwenden, um eine narbenfreie Insertion von DNA-Fragmenten zu ermöglichen. Die spezifischen Grundierungen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
4. Die pET28a (+)-rAbs-APN-BL21-transformierten Bakterien werden in Gegenwart von 0,4 mM IPTG in Orbitalschüttlern bei 37 °C für 10 h gezüchtet. Induzieren, reinigen und beurteilen Sie dann die Expression des rAbs-Proteins mithilfe der routinemäßigen Proteinreinigung.
5. 100 μl 0,5 x 10⁵ CHO-Zellen pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte säen und bei 37 °C in einer 6 % CO₂ -Atmosphäre für 18-24 h inkubieren. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80-90 % erreichen, verdünnen Sie das pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-Plasmid mit Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 0,1 μg/μl und inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur, bevor Sie es zur Transfektion verwenden.
6. Mischen Sie vorsichtig 50 μl verdünntes pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-Plasmid mit 1 μl Lipofectamine 2000 und 49 μl Opti-MEM und inkubieren Sie die Mischung für weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur. 100 μl der Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit CHO-Zellen geben und bei 37 °C in 6 % CO₂ -Atmosphäre für 4-6 h inkubieren.
7. 4-6 h nach der Transfektion das Medium durch DMEM-F12-Medium ersetzen, das mit 10 % FBS versetzt ist, und die Platte weitere 48 Stunden inkubieren. Geben Sie dann 400 μg/ml G418 in jede Vertiefung, um die stabil transfizierten Zellen auszuwählen.
8. Nach 10-tägiger Selektion mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 400 μg/ml G418, sortieren Sie die Zellen (3,0 × 10⁷ Zellen/ml) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Etwa 10-15% der Zellpopulation waren positiv.
9. Entnommene positive Zellen seriell verdünnen, durchschnittlich 0,5 bis 2 Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte säen und in einem 37 °C_heißen Inkubator mit 6 % CO 2 kultivieren. Die stabil transfizierten pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen werden durch Selektion mit G418 (200 μg/ml) beibehalten.
Die
10. FBS-Konzentration im oben beschriebenen Zellkulturmedium sinkt während der logarithmischen Wachstumsphase über den Zeitraum von 3 Wochen allmählich von 10% auf 0%. Passen Sie dann die adhärenten CHO-Zellen in einem serumfreien Medium an das Suspensionswachstum an.
11. Kultivieren Sie die ausgesäten pIRES2-ZsGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase in serumfreiem Medium bei einer Dichte von 0,8-1,0 × 10⁵ Zellen/ml in Schüttelkolben bei 80-110 U/min Schüttelgeschwindigkeit und 37 °C, 6 % CO₂.
12. Entnehmen Sie die Zellsuspension alle 12 Stunden, um Veränderungen der Zellviabilität und -vitalität mit einem Zellzählkit (z. B. CCK-8) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
13. Die Antikörperexpression erreicht Spitzenwerte, wenn die Zellviabilität auf 80 % abnimmt und die Zelldichte 1,0-2,0 × 10⁶ Zellen/ml erreicht. Zellüberstände werden durch Zentrifugation entnommen, mit einem 0,22-μm-Polytetrafluorethylen-Membranfilter filtriert und mit Protein-A-Agarose gereinigt.
14. Bestätigung der Produktion von APN-spezifischen Antikörpern mit indirekten Immunfluoreszenz-Assays (IFA).
15. Bestimmen Sie Antikörpertiter und Bindungsaffinitäten mit dem ELISA-Assay wie zuvor beschrieben. Berechnen Sie die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D-Wert) der Antikörper mit einer logistischen Gleichung mit vier Parametern unter Verwendung einer Software.

Tabelle 1. Die spezifischen Primer, die in dieser Studie verwendet wurden.

Fibel	Sequenz (5'-3')
VH-VL-F	CCGGGTGGGCCGGATAGACMGATGGGGCTG
VH-VL-R	CCGGCCACATAGGCCCCACTTGACATTGATGT
pET28a (+)-F	TCCACCAGTCATGCTAGCCATAACAACGGTCGTGATTCGA
pET28a (+)-R	CTGGTGCCGCGCGGCAGCCAGTGGGATACCCGTATTACCC
pIRES2-ZsGreen1-F	CGACGGTACCGCGGGCCCGGTAACAACGGTCGTGATTCGA
pIRES2-ZsGreen1-R	GGGGGGGAGGGGGGGGGCGGTGGGATACCCGTATTACCC

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5881	Immunisierung von Tieren
DAPI	Beyotime Biotechnologie	Nr. C1002	Nukleare Gegenbeize
DMEM	Gibco	11965092	Zellkultur
DMEM-F12	Gibco	12634010	Zellkultur
Dylight 549-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper	Abbkine	Nr. A23310	Indirekte Immunfluoreszenzanalytik
Erweitertes Zellzähl-Kit-8	Beyotime Biotechnologie	Nr. C0042	Messung der Lebensfähigkeit und Vitalität der Zellen
Fötales Rinderserum	Gibco	Nr. 10091	Zellkultur
Geneticin™ selektives Antibiotikum	Gibco	11811098	Selektives Antibiotikum
HAT-Zuschlag (50X)	Gibco	21060017	Auswahl der Zellen
HT-Zuschlag (100X)	Gibco	11067030	Auswahl der Zellen
Unvollständiges Freund-Adjuvans	Sigma-Aldrich	Nr. F5506	Immunisierung von Tieren
Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid	Sigma-Aldrich	Nr. I5502	Protein-Expression
Kanamycin	Beyotime Biotechnologie	ST102	Bakterizides Antibiotikum
Leica TCS SP8 STED Konfokalmikroskop	Leica Mikrosysteme	SP8 STED	Fluoreszenz-Bildgebung
Lipofectamine® 2000 Reagenz	Thermofischer	11668019	Transfektion
LSRFortessa™ fluoreszenzaktivierte Zellsortierung	Bd	FACS LSRFortessa	Durchflusszytometrie
Mikroplatten-Reader	BioTek	KASTEN 998	ELISA-Analyse
Mikro-Spektralphotometer	Thermo Fischer	Nano Drop one	Nachweis der Nukleinsäurekonzentration
NaCl	Sinopharm Chemisches Reagenz	10019308	Kulturbrühe
(NH4)2SO4	Sinopharm Chemisches Reagenz	10002917	Kulturbrühe
Opti-MEM	Gibco	31985088	Zellkultur
Polyethylenglykol 1500	Roche Diagnostik	10783641001	Zellfusion
PrimeScript™ 1. Strang cDNA-Synthese-Kit	Takara Bio	Nr. RR047	qPCR
Protein A Agarose	Beyotime Biotechnologie	Nr. 2006	Aufreinigung von Antikörperproteinen
Protino® Ni+-TED 2000 gepackte Säulen	MACHEREY-NAGEL	Artikel-Nr.: 745120.5	Protein-Aufreinigung
SBA Klonotypisierungssystem-HRP	Südliche Biotechnologie	Mai-00	Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern der Maus
Nahtloses Klonen-Kit	Beyotime Biotechnologie	D7010S	Aufbau von Plasmiden
Flaschen schütteln	Beyotime Biotechnologie	Nr. E3285	Zellkultur
Natriumcarbonat-Natriumbicarbonat-Puffer	Beyotime Biotechnologie	Nr. C0221A	Zellkultur
Trans-Blot SD Halbtrockene Transferzelle	Bio-rad	Tel.: 170-3940	Western-Blot
Trypton	Oxoid	Nr. LP0042	Kulturbrühe
Ultraschall-Homogenisator	Ningbo Xinzhi Biotechnologie	JY92-IIN	Homogenisierung von Proben
Hefeextrakt	Oxoid	Nr. LP0021	Kulturbrühe
96-Well-Mikroplatte	Corning	Artikel-Nr.: 3599	Zellkultur