Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Isolierung von PBMCs und Anreicherung/Reinigung von NK-Zellen
HINWEIS: Andere Methoden zur Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) und zur Anreicherung/Reinigung können ebenfalls durchgeführt werden.
- Ziehen Sie unter regulierten Bedingungen 200 ml Blut in ein Röhrchen, das Heparin enthält.
- Geben Sie 15 mL des Dichtegradientenmediums in ein 50 ml-Röhrchen mit einer eingearbeiteten porösen Barriere. Die Tube 30 s lang bei 1000 x g drehen.
- Geben Sie 12,5 ml Blut in das Röhrchen, gefolgt von weiteren 12,5 ml PBS, und invertieren Sie es vorsichtig 3x. Drehen Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) bei Raumtemperatur (RT) ohne Pausen.
- Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 40 mL PBS für jedes Röhrchen mit einer porösen Barriere vor, während sich die Zellen drehen.
- Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig und prüfen Sie sie nach dem Zentrifugieren. Achten Sie auf eine dünne, sichtbar weiße Schicht aus PBMCs über der porösen Barriere zwischen den 20 mL und 25 mL Abgrenzungen auf dem 50 mL Röhrchen.
- Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette so viel Flüssigkeit wie möglich von der Oberseite, ohne die dünne, weiße PBMC-Schicht zu stören.
- Entfernen Sie mit einer sauberen serologischen 10-ml-Pipette vorsichtig die PBMC-Schicht zusätzlich zur klaren, gelblichen Flüssigkeitsschicht bis zum Filter des Röhrchens.
- Die PBMC und die Flüssigkeit werden in das in Schritt 1.4 hergestellte konische 50-ml-PBS-haltige 50-ml-Produkt ausgestoßen. Spin Tubes bei RT und 300 x g für 5 min.
- Aspirieren Sie die PBS-Wäsche und fügen Sie weitere 40 ml PBS hinzu. Spin Tubes bei RT und 300 x g für 5 min.
- Nach dem Waschen werden die Zellen gezählt und in 40 μl 2 % BSA/PBS pro 1 x 107 Zellen resuspendiert.
- Fahren Sie mit der Isolierung der NK-Zellen mit der Methode Ihrer Wahl fort. Zur Auswahl steht eine manuelle oder automatisierte Sortierung auf Basis von Magnetbeads. Auch eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kann durchgeführt werden.
- Entnehmen Sie ein kleines Aliquot von Zellen, um die Reinheit der NK-Zellen durch Durchflusszytometrie zu bestimmen. Die Gating-Strategie umfasst Folgendes: Gate auf lebenden Zellen basierend auf dem Vorwärts- und Seitenstreuprofil, dann Bewertung der Reinheit anhand von NK-Markern (z. B. CD3, CD56) in der spezifischen lebenden Population. Die typische Reinheit beträgt >95%.
- Nachdem die Isolierung abgeschlossen ist, drehen Sie die Zellen 5 Minuten lang bei RT und 300 x g, um sie zu pelletieren und zu aspirieren.
- Resuspendieren Sie das Zellpellet auf 1 x 107 Zellen/ml in RPMI 1640 mit Nährstoffen, 10 % hitzeinaktiviertem FBS, 1 mM Natriumpyruvat, 55 mM 2-ME und 10 mM HEPES (pH = 7,2).
>2. Antikörper-vermittelte Aktivierung von NK-Zellen über FcγRIIIa
- Eine gekühlte Mikrozentrifuge auf 4 °C einstellen.
- 1 x 106 (100 μl resuspendierte NK-Zellen) in 1,5 ml-Röhrchen geben und auf Eis legen.
Anmerkung: Die Zellen können in eine 96-Well-U-Bodenplatte dosiert werden, wenn zahlreiche Proben vorhanden sind.
- Bereiten Sie 1 μl 100 μg/ml Rituximab (oder Antikörper von Interesse) pro Probe vor und fügen Sie den Zellen 1 μl hinzu, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml Antikörper zu erreichen.
Anmerkung: Andere Moleküle können den Zellen zu diesem Zeitpunkt oder früher zugesetzt werden, um Kombinationseffekte zu beurteilen. Hier wurde Ritixumab zur Stimulation eingesetzt. In früheren Studien wurden niedermolekulare Inhibitoren zu Stimulationen hinzugefügt.
- Inkubieren Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis. Während der Inkubation werden 50 μl 50 μg/ml Anti-Human-κ-Leichtketten-Antikörper pro Probe in einem Medium hergestellt und auf einem Wärmeblock oder in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmt.
- Nach der Inkubation der Zellen auf Eis 1 ml eiskaltes Medium hinzufügen und bei 135 x g für 5 min bei 4 °C schleudern. Erneut mit 1 mL eiskaltem Medium waschen.
- Der Überstand wird nach der letzten Wäsche aspiriert und 50 μl des in Schritt 2.4 hergestellten humanfeindlichen κ-Leichtkettengemisches zugegeben.
- Inkubieren Sie die Proben sofort für die vom Endbenutzer festgelegten Zeitpunkte bei 37 °C auf einem Heizblock oder in einem Wasserbad.
- Beenden Sie die Stimulation, indem Sie 1 mL eiskaltes Medium hinzufügen und die Proben sofort 5 Minuten lang in einer gekühlten Zentrifuge bei 135 x g schleudern. Erneut mit 1 mL eiskaltem Medium waschen.
