Eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen

Zusammenfassung

Quelle: Devilder, M., et al. Erzeugung von diskriminativen humanen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifischen B-Zellen, die im Blut zirkulieren. J. Vis. (2018).

Das Video demonstriert eine Technik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper aus antigenspezifischen B-Zellen. Eukaryotische Expressionsvektoren, die für die schweren und leichten Ketten von Antikörpern kodieren, die von isolierten antigenspezifischen B-Zellen kloniert wurden, werden mit Hilfe von Polyplexen in Säugetierzellen eingeführt. Sobald sich diese Vektoren in den Zellen befinden, durchlaufen sie eine Translation, und die resultierenden schwer- und leichtkettigen Peptide lagern sich zu Antikörpern zusammen, die anschließend von den Zellen sezerniert werden.

Protokoll

>1. Produktion von mAbs

1. Am Tag vor der Transfektion säen Sie 15.000 humane embryonale Nieren-293A-Zellen (HEK 293A) in 200 μl des modifizierten Eagle-Mediums (DMEM) von Dulbecco, ergänzt mit 10 % FBS pro Vertiefung in 96-Well-Platten. Über Nacht in einem CO₂ -Inkubator (5 % CO₂) bei 37 °C inkubieren.
2. Cotransfect 293A-Zellen in DMEM-Medium, das 10 % FBS enthält, unter Verwendung eines linearen Polyethyleniminderivats als Transfektionsreagenz.
   Anmerkung: Führen Sie die Transfektion in dreifacher Ausfertigung durch. Das folgende Protokoll gilt für eine Vertiefung einer 96-Well-Platte mit flachem Boden.
   1. 0,5 μl DNA-Transfektionsreagenz in 10 μl 150 mM NaCl verdünnen. 0,125 μg variable schwere Kette (vH) und 0,125 μg variable Leichtkette (vL) exprimierende Vektoren werden zu 10 μl 150 mM NaCl verdünnt. Jede Verdünnung 10 s lang vortexen.
   2. Geben Sie 10 μl verdünntes DNA-Transfektionsreagenz in die 10 μl DNA-Lösung. 15 s vortexen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. Geben Sie die 20-μl-Mischung tropfenweise auf die 293A-Zellen und mischen Sie, indem Sie die Platte vorsichtig schwenken.
3. Das Medium 16 h nach der Transfektion austauschen und die Zellen 5 Tage lang in serumfreiem Medium kultivieren.
   Anmerkung: Verwenden Sie serumfreies Medium, um zu vermeiden, dass Serum-Immunglobuline (Igs) die produzierten Antikörper kontaminieren.
4. Beseitigen Sie Zellen und Ablagerungen durch Zentrifugation bei 460 x g für 5 Minuten.
5. Ernten Sie Überstände durch Aspiration mit einer Mehrkanalpipette und überführen Sie sie in eine 96-Well-Platte mit V-Boden.
6. Relevantes Ag über Nacht bei 4 °C in 100 μl pro Well des rekonstituierten ELISA-Beschichtungspuffers (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) / ELISPOT-Beschichtungspuffers (Enzyme-linked Immunosorbent Spot) 1x bei einer Endkonzentration von 2 μg/ml in 96-Well-ELISA-Platten beschichten.
7. Blocken Sie Vertiefungen mit 10% FBS DMEM-Medium für 2 h bei 37 °C.
8. 50 μl Überstände von transfizierten 293A-Zellen aus Schritt 1.5 zugeben und 2 h bei RT inkubieren.
9. 100 μl eines Anti-Human-Immunglobulin-G-Antikörpers (IgG Ab), konjugiert mit Meerrettichperoxidase (HRP) in einer Menge von 1 μg/ml und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren. 50 μl chromogenes Substrat (3,3',5,5' Tetramethylbenzidin, TMB) zugeben und 20 min inkubieren.
10. Optische Dichten bei 450 nm mit einem Spektralphotometer ablesen.
    Anmerkung: Die spezifischen mAbs, die durch den ELISA-Assay aufgedeckt werden, können weiter in großem Maßstab hergestellt und auf einer Protein-A-Säule gereinigt werden, die eine Affinität für humanes IgG aufweist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
HEK 293A-Zelllinie	Thermo Fisher wissenschaftlich	Nr. R70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modifizierter Eagle Medium	Gibco von life technologies	Artikel-Nr.: 21969-035	(+) 4,5g/L D-Glukose 0,11g/L Natriumpyruvat (-) L-Glutmin
Nutridoma-SP	Roche	11011375001	100X Konz
Fötales Rinderserum (FBS)	Dominique Dutscher	Nr. S1810-500
Jet PEI DNA-Transfektionsreagenz	PolyPlus	Nr. 101-40
96-Well-Platte mit flachem Boden	Falke	353072
96-Well-Platte mit V-Boden	Nunc/Thermofisher	Artikel-Nr.: 55142