Konvektionsverstärkte Verabreichung von Antikörpern in ein Mäusegehirn

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung der Stufenkatheter

1. Vorbereitung eines Quarzglasschlauchs für die Stufe des Katheters
   1. Schneiden Sie den Quarzglas-Schlauch mit einem Innendurchmesser von 0,1 mm und einer Wandstärke von 0,0325 mm auf eine Länge von 30 mm.
   2. Untersuchen Sie den Schlauch auf Risse und polieren Sie die Enden mit einer Mikroschmiede heiß, um sicherzustellen, dass die Schlauchöffnungen eine glatte Oberfläche haben.
2. Fixierung des Schlauches in einer Metallnadel
   1. Montieren Sie eine 27 G Nadel auf eine 10 μL Spritze und platzieren Sie die Spritze in einem stereotaktischen Roboter.
   2. Bewegen Sie die Spritze mit dem Roboter über eine harte Oberfläche und berühren Sie sie mit der Nadelspitze. Diese Position sollte in der Software notiert oder gespeichert werden, da sie als Referenzfläche für die Einstellung der Länge des Katheterschritts dient.
   3. Heben Sie die Nadel an, damit die Quarzglaskapillare in die Nadel eingesetzt werden kann.
   4. Platzieren Sie die Quarzglaskapillare so in der Nadel, dass 20 mm der Kapillare aus der Nadel herausragen.
   5. Verteilen Sie mit einer Pipette gleichmäßig 2 μl hochviskosen Cyanacrylat-Klebstoff auf der Kapillare, beginnend mit der Metallnadel und endend 10 mm über dem unteren Ende der Kapillare, wie in Abbildung 1 dargestellt.
   6. Senken Sie die Nadel mit dem stereotaktischen Roboter ab, bis sich die Spitze der Metallnadel 1 mm über der Referenzoberfläche befindet. Auf diese Weise wird die Quarzglaskapillare in der Metallnadel fixiert und bildet einen Schritt von 1 mm von der Spitze entfernt. Entfernen Sie überschüssigen Kleber, der sich am Ende der Metallnadel bildet, um eine Abstumpfung der Stufe zu vermeiden.
   7. Warten Sie 15 Minuten, bis der Kleber ausgehärtet ist, und entfernen Sie die Spritze mit dem Katheter aus dem stereotaktischen Roboter. Vergewissern Sie sich, dass der überschüssige Kleber bei diesem Schritt entfernt wurde, indem Sie die Spitze des Katheters unter einem Mikroskop überprüfen.
3. Testen des Stufenkatheters mit einem Block Agarose
   1. Bereiten Sie 0,6%ige Agaroselösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer herkömmlichen Gelschale vor und warten Sie, bis sie polymerisiert ist. Die Agarose in ca. 20 mm x 20 mm große Blöcke schneiden. Bewahren Sie die Blöcke bis zur Verwendung in PBS ein.
   2. Füllen Sie die Stufenkatheterspritze manuell mit 10 μl 0,4%iger Lösung aus gefiltertem Trypanblau.
   3. Dispensieren Sie mit dem stereotaktischen Roboter 1 μl bei 0,2 μl/min, um die Versiegelung des Katheterschritts während des Fixationsverfahrens zu beurteilen. Die Trypanblau-Lösung sollte nur an der Spitze des Katheters sichtbar sein. Wische es mit einem Papiertuch ab.
   4. Platzieren Sie den Agaroseblock in den stereotaktischen Roboter und kalibrieren Sie den Roboter so, dass die Spitze des Katheters auf die Oberfläche des Agaroseblocks zeigt.
   5. Programmieren Sie die Injektionsparameter für CED.
      1. Für ein Injektionsvolumen von 5 μl gehen Sie wie folgt vor: 1 μl bei 0,2 μl/min, dann 2 μl bei 0,5 μl/min und 2 μl bei 0,8 μl/min. Passen Sie das endgültige Injektionsvolumen entsprechend dem spezifischen Versuchsplan an, indem Sie die Dauer der einzelnen Schritte proportional ändern.
      2. Um die Lösung in murines Caudatputamen (Striatum) zu injizieren, führen Sie eine solche Injektion in einer Position 1 mm frontal und 1,5–2 mm lateral vom Bregma in einer Tiefe von 3,5 mm durch.
      3. Lassen Sie den Katheter nach der Injektion 2 Minuten lang an Ort und Stelle und ziehen Sie ihn dann mit 1 mm/min zurück, um eine korrekte Flüssigkeitsverteilung im Gehirn zu gewährleisten und den Injektionstrakt während der Katheterentfernung abzudichten.
         Anmerkung: Alle Parameter können in einem einzigen Skript programmiert werden, abhängig vom jeweiligen stereotaktischen Roboter.
   6. Starten Sie das CED-Verfahren und injizieren Sie 5 μl Trypanblaulösung in den Agaroseblock.
   7. Beurteilen Sie die Form einer Wolke aus Trypanblau in der Agarose und mögliche Leckagen entlang des Kathetertrakts. Trypanblau sollte ein Ellipsoid oder eine runde Wolke bilden, wobei die Mitte um die Katheterspitze herum liegt und einen Durchmesser von mindestens 1 mm hat. Es sollte kein größerer Rückfluss über die Spitze der Metallnadel sichtbar sein.
   8. Legen Sie einen neuen Agaroseblock an und beginnen Sie eine zweite Injektion von 1 μl bei 0,2 μl/min, um die Verstopfung des Katheters mit der Agarose zu beurteilen. Trypanblau sollte unmittelbar nach Beginn der Injektion wieder beginnen, eine Wolke von der Spitze des Katheters zu bilden.
   9. Beurteilen Sie, ob das verbleibende Volumen in der Spritze 3 μl entspricht. Jegliche Abweichungen können auf ein Austreten von Flüssigkeit durch die Katheterhalterung oder den Spritzenkolben hinweisen.
   10. Wenn alle Testinjektionen erfolgreich waren, der Katheter gut abgedichtet und gerade ist und an anderen Stellen als der Katheterspitze keine Trypanblau-Lösung beobachtet wird, waschen Sie den Katheter mit deionisiertem H₂O (dH₂O), bis keine Spuren von Trypanblau mehr sichtbar sind, und waschen Sie ihn dann zehnmal wie folgt: 70 % Ethanol und 100 % Ethanol, gefolgt von erneutem Spülen mit 70 % Ethanol und sauberem entionisiertem Wasser.
   11. Lagern Sie den Katheter unter trockenen Bedingungen.

>2. Konvektionsverstärkte Abgabe von Antikörperlösung in das Gehirn der Maus

HINWEIS: Abhängig von den örtlichen Tierschutzbestimmungen können verschiedene Arten von Anästhetika, Analgetika und Antibiotika für dieses Verfahren eingesetzt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung einer Injektionsanästhesie. Inhalationsanästhetika wie Isofluran können auch verwendet werden, indem eine Nasenmaske auf dem stereotaktischen Rahmen montiert wird. Zusätzlich empfehlen wir die Zugabe von Antibiotika zum Trinkwasser zur Infektionsprophylaxe.

1. Chirurgischer Aufbau
   1. Bereiten Sie Anästhetika und Gegengiftlösungen vor. Mäuse können sicher mit einer Dreikomponenten-Anästhesie anästhesiert werden, die Fentanyl (0,05 mg/kg), Midazolam (5 mg/kg) und Medetomidin (0,5 mg/kg) enthält, verdünnt in sterilem destilliertem Wasser (dH₂O). Wir führen ein zweistufiges Weckverfahren mit zwei Antidotlösungen durch, von denen eine Flumazenil (0,5 mg/kg) und Buprenorphin (0,1 mg/kg) in sterilem dH₂O (erste Antidotlösung) enthält. Die zweite enthält Atipamezol (2,5 mg/kg) in steriler dH₂O (zweite Gegengiftlösung).
   2. Bereiten Sie eine Analgesielösung vor, die Carprofen (5,667 mg/kg) enthält, verdünnt mit sterilem dH₂O.
   3. Reinige den stereotaktischen Rahmen, das Heizkissen und die Elemente des stereotaktischen Roboters. Beachten Sie, dass nicht alle Roboterteile ohne Beschädigungsgefahr gereinigt werden können. Weitere Informationen zur Reinigung und Vorbereitung für den Einsatz finden Sie im Handbuch des Roboters.
   4. Montieren Sie die Spritze mit dem Stufenkatheter und spülen Sie sie mehrmals mit dH₂O, 70 % Ethanol und 100 % Ethanol, gefolgt von einer erneuten Spülung mit 70 % Ethanol und dH₂O. Spülen Sie schließlich die Spritze mit PBS oder anderen Puffern, um die Lösung für die intrakranielle Injektion, z. B. künstliche Zerebrospinalflüssigkeit, vorzubereiten. Der Spritzenkolben sollte sich während des Eingriffs reibungslos und frei bewegen.
   5. Kalibrieren Sie die stereotaktische Robotersoftware mit dem stereotaktischen Rahmen.
   6. Testen Sie die stereotaktische Robotersoftware, indem Sie sicherstellen, dass sich die Roboterarme frei bewegen, dass die Injektionspumpe ordnungsgemäß angeschlossen ist und dass sie den CED-Vorgang störungsfrei durchführen kann. Dazu gehören das Testen der Roboterbewegung, das Rampeneinspritzen, das Überprüfen des 2-minütigen Warteschritts und das Überprüfen der Geschwindigkeit des Kathetereinzugs. Alle Parameter sollten mit dem in Nummer 1.3.5 beschriebenen vorprogrammierten CED-Verfahren übereinstimmen.
   7. Setzen Sie den Bohrer in den Bohrer ein. Es wird empfohlen, die Bohrer vor dem Gebrauch zu sterilisieren.
   8. Bereiten Sie die Antikörperlösung mit PBS oder anderen Pufferlösungen wie z. B. künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) vor. 1 bis 20 μg Antikörper in 5 μl können in einem einzigen CED-Verfahren injiziert werden. Andere Volumina und Proteinmengen sollten vor der Durchführung des Experiments getestet werden. Beachten Sie, dass die Verwendung von hochviskosen Lösungen zu einer Verstopfung des Katheters führen kann.
   9. Laden Sie die Spritze manuell mit dem verdünnten Antikörper.
2. Antikörperinjektion durch CED in das Striatum
   1. Wiegen Sie die Maus und injizieren Sie die Dreikomponenten-Anästhesielösung entsprechend dem Körpergewicht in das Bauchfell. Beachten Sie die Einspritzzeit. Bringen Sie die Maus in einen separaten Käfig, der mit einem Heizkissen beheizt wird.
   2. Beobachten Sie die Maus, um festzustellen, wann die Sedierung beginnt. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt, tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um die Hornhaut während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen. Die vollständige Sedierung beginnt in der Regel 10–15 Minuten nach der Injektion der Dreikomponenten-Anästhesielösung.
   3. Überprüfen Sie die Schmerzreaktionen mit dem Pinch-Reflex-Test, um eine vollständige Anästhesie des Tieres sicherzustellen.
   4. Rasieren Sie den Kopf mit einem Haarschneider.
   5. Desinfizieren Sie die Haut mit Wattestäbchen, die in Jodlösung getränkt sind. Schrubben Sie die Haut dreimal in kreisenden Bewegungen.
   6. Machen Sie einen 10 mm Hautschnitt entlang der kranialen Mittellinie und schließen Sie mit einem Skalpell auf Augenhöhe ab.
   7. Fixieren Sie die Maus mit der Nasenklemme und den Ohrbügeln im stereotaktischen Rahmen. Stellen Sie sicher, dass die Schädeloberfläche waagerecht und fest befestigt ist. Neben der korrekten anatomischen Navigation ist es auch entscheidend, ein Kippen des Schädels während der Bohrung und des CED-Eingriffs zu vermeiden.
   8. Platzieren Sie die Spritze in den stereotaktischen Roboter.
   9. Synchronisieren Sie den Bohrer mit der Spitze des Katheters an einem Referenzpunkt. Das Verhältnis zwischen der Position des Bohrers und der Spritze muss in der Software genau bestimmt werden, damit die Injektion in der gewünschten anatomischen Region des Gehirns durchgeführt werden kann.
   10. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette zurück und lokalisieren Sie das Bregma auf der Schädeloberfläche.
   11. Referenzieren Sie Bregma in der Software mit der Bohrerspitze.
   12. Bewegen Sie den Bohrer in eine Position 1 mm frontal und 2 mm lateral von Bregma entfernt und bohren Sie ein Bohrloch. Achten Sie darauf, die Dura Mater nicht zu beschädigen.
   13. Bewegen Sie die Spritze über das Fräsloch.
   14. Geben Sie 0,5–1 μl aus der Spritze ab, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen im Katheter verbleiben.
   15. Starten Sie das in Punkt 1.3.5 beschriebene CED-Programm. Beobachten Sie die Schädeloberfläche auf Spuren von Flüssigkeitsrückfluss von der Injektionsstelle. Überwachen Sie die Atemfrequenz des Tieres.
   16. Sobald das CED-Programm beendet ist und der Katheter aus dem Gehirn gezogen wird, starten Sie die Injektionspumpe bei 0,2 μl/min, um zu prüfen, ob der Katheter während der CED verstopft ist. Wenn keine Verstopfung aufgetreten ist, sollten Sie sofort einen Tropfen Injektionsmischung aus der Katheterspitze sehen.
   17. Vor der Wiederverwendung oder Lagerung des Katheters die Katheterstufe unter dem Mikroskop visuell auf Beschädigungen oder Verschleißerscheinungen untersuchen und wie in Schritt 1.3.10 gereinigt werden.

Abbildung 1: Eine schematische Zeichnung, die den Anwendungsbereich des Klebstoffs darstellt. Die oberen 10 mm des Quarzglasschlauchs werden in die Metallnadel eingeführt. Tragen Sie den Kleber auf den 10 mm Schlauch auf, beginnend mit der Spitze der Metallnadel.