Ein zellbasierter Assay zur Beurteilung der Aufnahme des Tau-Proteins durch Mikroglia

>1. BV-2 Mikroglia-Zellkultur

HINWEIS: Behandeln Sie BV-2-Zellen unter Eindämmung der Biosicherheitsstufe 2. Die BV-2-Zelllinie produziert ein behülltes rekombinantes ökotropes Retrovirus (das nur Mauszellen infizieren kann); Solche Viren sind bekannt für ihre in vitro transformierende Fähigkeit und ihr in vivo tumorigenes Potenzial.

1. Kultivieren Sie BV-2-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin (von nun an als Kulturmedium bezeichnet), indem Sie Zellen bei 4 x 10⁴ Zellen/ml aussäen.
2. Bewahren Sie die Kulturen in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 °C auf.
   HINWEIS: Die Zellen wachsen locker gebunden und in Suspension.

>2. Rekombinante Tau-Aggregate mit pH-sensitivem Fluoreszenzfarbstoff markieren

HINWEIS: Tau-Aggregate wurden wie in Apetri et al. beschrieben hergestellt.mit dem Unterschied, dass dem Reaktionspuffer kein Thioflavin T (ThT) zugesetzt wurde. Die aggregierten Proben wurden in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen entnommen. Das endgültige Fluoreszenzsignal wurde überprüft, indem 118 μl der Poolprobe mit 12 μl einer 50 μM ThT-Lösung gemischt wurden. Die Trennung der Zuschlagstoffe erfolgte durch Zentrifugieren des Aggregationsreaktionsgemisches bei 20.000 x g für 1 h bei 4 °C. Der Überstand wurde mit SEC-MALS analysiert, um zu bestätigen, dass das gesamte monomere Tau in Aggregate umgewandelt wurde. Die Pellets (Tau-Aggregate) wurden schockgefroren und in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert.

1. Resuspendieren Sie Tau-Aggregate in 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (NaHCO₃) bei pH 8,5 bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml (~ 20 μM).
   Anmerkung: Die Konzentration der Tau-Aggregate basiert auf der anfänglichen Monomerenkonzentration, die durch die Absorption von Tau-Monomeren bei 280 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 0,31 ^{mLmg-1 cm-1} bestimmt wird.
2. Beschallen Sie die resuspendierten Zuschlagstoffe mit einem Sondensonden-Ultraschallgerät, während Sie sie auf Eis halten, um eine Überhitzung zu vermeiden.
   1. Verwenden Sie eine Amplitude von 65% (mit einem Ultraschallgerät mit einer Leistung von 250 W).
   2. Führen Sie 8 Impulse von 3 s mit Pausen von 15 s zwischen den Impulsen durch, um eine Überhitzung zu vermeiden.
3. Bereiten Sie eine 8,9 mM Stammlösung aus pH-empfindlichem Farbstoff (im Folgenden als pH-Farbstoff bezeichnet) in Dimethylsulfoxid (DMSO) gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
   Anmerkung: Bereiten Sie immer eine frische Lösung vor und verwenden Sie sie nur am Tag der Zubereitung.
4. Fügen Sie 10 Mol Farbstoff pro Mol Protein zu einer endgültigen Farbstoffkonzentration von 0,2 mM hinzu.
5. Mischen Sie, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.
6. Das Reaktionsgemisch 45–60 min bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren.
7. In der Zwischenzeit wird eine vernetzte Dextran-Gel-Entsalzungssäule gemäß den Anweisungen des Herstellers montiert.
8. Die Säule wird mit 25 mL 0,1 M NaHCO₃ Puffer pH 8,5 mit 3 % DMSO äquilibriert. Verwerfen Sie den Durchfluss.
9. Geben Sie das Produkt der Tau-Aggregatmarkierungsreaktion in einem Gesamtvolumen von 2,5 ml in die Säule. Wenn die Probe weniger als 2,5 ml enthält, fügen Sie Puffer hinzu, bis ein Gesamtvolumen von 2,5 ml erreicht ist.
10. Lassen Sie die Probe vollständig in das verpackte Gel gelangen, entsorgen Sie den Durchfluss.
11. Eluieren Sie mit 3,5 mL 0,1 M NaHCO₃ Puffer pH 8,5 mit 3 % DMSO und sammeln Sie das Eluat in 4 äquivalenten Fraktionen in 2 mL Röhrchen.
12. Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen der 4 Fraktionen durch Bicinchoninsäure (BCA)-Assay.
13. Lagern Sie das markierte Protein in einem -20 °C Gefrierschrank.

>3. Aufnahmeassay mit Auslesung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)

1. Tag 1 – Aussaat der Zellen
   1. BV-2-Zellen werden im Kolben gewaschen, indem das Kulturmedium entfernt und 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zugegeben wird.
      Anmerkung: Das Waschvolumen variiert je nach Größe des verwendeten Zellkolbens. Waschen Sie beispielsweise für einen T175-Kolben mit 10 ml 1x PBS.
   2. PBS aus dem Kolben nehmen und die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) 0,05 % bei 37 °C und 5 % CO₂ ablösen, bis sich die Zellen vom Kolben lösen (ca. 5 min).
      Anmerkung: Das Volumen von Trypsin-EDTA 0,05 % hängt von der Größe des verwendeten Zellkolbens ab. Verwenden Sie beispielsweise für einen T175-Kolben 2 ml Trypsin-EDTA 0,05 %.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen im Kulturmedium, indem Sie drei- bis fünfmal auf und ab pipettieren.
      HINWEIS: Das Volumen des Kulturmediums variiert je nach Größe des verwendeten Zellkolbens und damit der Gesamtzahl der Zellen im Kolben. Verwenden Sie z. B. für einen T175-Kolben 8 ml Kulturmedium.
   4. Zählen Sie die Zellen und erstellen Sie eine Zellsuspension mit einer Endkonzentration von 1 x 10⁵ Zellen/ml in Kulturmedium mit 200 μg/ml Heparin.
   5. Platte: 250 μl Zellsuspension (2,5 x 10,⁴ Zellen) pro Well in einer 96-Well-Gewebekulturplatte mit flachem Boden.
   6. Die Platte über Nacht bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
2. Tag 1 – Immunkomplexe vorbereiten
   1. pH-Farbstoff-Tau auf Eis auftauen.
   2. Bereiten Sie 65 μl pro Bedingung einer 500 nM Lösung von pH-Farbstoff-Tau-Aggregaten in serumfreiem Medium (SFM) vor (DMEM mit hohem Glukosegehalt, ergänzt mit 100 μg/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 200 μg/ml Heparin).
   3. Bereiten Sie Antikörperverdünnungen in 65 μl SFM in einer Konzentration vor, die doppelt so hoch ist wie die Endkonzentration. Mischen Sie pH-Farbstoff-Tau-Aggregate und Antikörper in einer 96-Well-U-Bodenplatte. Das endgültige Volumen pro Bedingung beträgt nun 130 μl und die pH-Konzentration der Farbstoff-Tau-Aggregate 250 nM. Verschließen Sie die Verdünnungsplatte und inkubieren Sie sie über Nacht bei 37 °C.
3. Tag 2 – Aufnahme von Immunkomplexen
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus den BV-2-Zellen. Waschen Sie die Zellen einmal mit 100 μL Raumtemperatur 1x PBS.
   2. Übertragen Sie 125 μl Immunkomplexe mit einer Mehrkanalpipette auf die Zellen. Inkubieren Sie die Zellen mit den Immunkomplexen für 2 h bei 37 °C und 5 % CO₂.
   3. Entfernen Sie das Inkubationsmedium aus den Zellen und entsorgen Sie es. Waschen Sie die Zellen einmal mit 100 μL Raumtemperatur 1x PBS.
   4. 1x PBS entfernen und die Zellen mit 50 μL Trypsin-EDTA 0,25 % für 20 min bei 37 °C und 5 % CO_{2 behandeln.}
   5. Fügen Sie 200 μl Kulturmedium hinzu und resuspendieren Sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren, um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen auf eine 96-Well-U-Bodenplatte. Zentrifugierte Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
   6. Legen Sie die Platte auf Eis, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal, indem Sie die Zellpellets in 150 μL eiskalt 1x PBS resuspendieren. Zentrifugierte Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
   7. Legen Sie die Zellen auf Eis, entfernen Sie das zugesetzte 1x PBS und waschen Sie sie, indem Sie die Zellpellets in 150 μl kaltem FACS-Puffer (1x PBS, 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA), 2 mM EDTA) resuspendieren. Zentrifugierte Platte bei 400 x g für 5 min bei 4 °C.
   8. Legen Sie die Zellen auf Eis, entfernen Sie den hinzugefügten FACS-Puffer und resuspendieren Sie die Zellen in 200 μl kaltem FACS-Puffer.
   9. Analysieren Sie die Proben sofort, indem FACS 2 x 10⁴ Ereignisse im Live-Cells-Gate erfasst (siehe Schritt 4.1).