>1. Aufreinigung von Antikörpern
HINWEIS: Der Äquilibrierungspuffer für den hauseigenen Antikörper beträgt 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Der verwendete Elutionspuffer beträgt 0,1 M Essigsäure. Die Puffer und das Harz (Protein A) werden abhängig vom spezifischen Antikörper gereinigt. Das Säulenvolumen entspricht der Betthöhe des Harzes. Die Menge der verwendeten mobilen Phase wird anhand des Säulenvolumens bestimmt.
- Initialisierung des Reinigungssystems
- Öffnen Sie die Software, die an das Reinigungssystem angeschlossen ist. Äquilibrieren Sie die Säule mit dem Äquilibrierungspuffer mit dem Äquilibrierungspuffer bei einer Flussrate von 2 mL/min für 40 min. Stoppen Sie den manuellen Lauf nach der Äquilibrierung.
- Platzieren Sie in den Fraktionssammler konische 15-ml-Röhrchen zum Auffangen des gereinigten Antikörper-Eluats und konische 50-ml-Röhrchen zum Auffangen des Durchflusses während der Salzwäsche. Stellen Sie sicher, dass der Fraktionssammler in die Ausgangsposition zurückgesetzt wird, indem Sie den Fraktionssammler vor Beginn der Fahrt öffnen und schließen. Der Fraktionssammler wird bei 7 °C gehalten.
Anmerkung: Der Fraktionssammler kann manuell auf der Registerkarte Fraktionssammler in den Einstellungen zurückgesetzt werden, sowohl für 15-ml- als auch für 50-ml-Röhrchen.
- Injektion von Proben
Anmerkung: Die geerntete Zellkulturflüssigkeit, die in den folgenden Verfahren verwendet wird, wurde aus Ovarialzellen des chinesischen Hamsters gewonnen, die in automatisierten Mikrobioreaktoren kultiviert wurden.
- Geben Sie die 0,22 μm gefilterte Erntezellkulturflüssigkeit in eine leere 12-ml-Spritze, deren Düsenende verschlossen ist.
- Halten Sie die Spritze mit der Düse nach unten und führen Sie den Spritzenkolben ein, bis ein kleiner Teil des Kolbens eingelegt ist. Vergewissern Sie sich, dass die Flüssigkeit nicht austritt, drehen Sie die Spritze mit der Düse nach oben und entfernen Sie die Kappe.
- Halten Sie die Spritze immer noch mit der Düse nach oben fest und drücken Sie den Zylinder, um jegliche Luft abzuleiten, bis sich die Zellkulturflüssigkeit an der Spitze der Düse befindet. Führen Sie die Spritzendüse in die manuelle Injektionsöffnung des Reinigungssystems ein und drehen Sie sie, um sie festzuziehen.
- Drücken Sie den Kolben nach unten, bis die gesamte Probe injiziert ist und in der beigefügten 10-ml-Probenschleife mit großem Volumen sichtbar ist.
- Öffnen Sie die gespeicherte Methodendatei. Speichern Sie die Ergebnisdatei am gewünschten Speicherort, und geben Sie den Dateinamen an, wenn Sie dazu aufgefordert werden. Hit Run, nachdem die Probe in die Sample-Schleife mit großem Volumen injiziert wurde.
- Ausführen der Reinigungsmethode
- Wählen Sie die gespeicherte Methode aus und klicken Sie auf Ausführen, wenn Sie von der Gerätesoftware dazu aufgefordert werden (Schritt 1.2.5).
Anmerkung: Das System ist so eingerichtet, dass es die folgenden Schritte ausführt. Der Benutzer muss nichts tun, während das Gerät läuft.
- Die Säule wird mit drei Säulenvolumina (CVs) Äquilibrierungspuffer bei einer Flussrate von 2 ml/min äquilibriert. Sobald die Säule äquilibriert ist, injiziert das System die Probe mit Hilfe der großvolumigen Probenschleife mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die Säule.
- Ein Abfall des UV-Signals bei 280 nm zeigt an, dass die Probe fertig geladen ist. Waschen Sie die Säule mit Äquilibrierungspuffer bei einer Flussrate von 2 ml/min, bis das UV-Signal unter 25 mAU fällt.
- Verwenden Sie vier CVs von 25 mM Tris mit 1 M NaCl bei pH 7,5, um eine sekundäre Salzwäsche mit einer Flussrate von 2 mL/min durchzuführen. Der Systemfraktionssammler sammelt alle Proteine/DNA, die während der Salzwäsche aus der Säule kommen, in 50-ml-Röhrchen.
- Geben Sie fünf CVs Elutionspuffer mit einer Flussrate von 1 ml/min, um den Antikörper von der Säule zu eluieren. Sammeln Sie das Eluat in 15-ml-Röhrchen basierend auf dem UV-Signal; wenn das UV 280-Signal über 35 mAU liegt, beginnt die Erfassung; Die Sammlung endet, wenn das Signal unter 50 mAU fällt; Dies wird als Spitzenschnitt bezeichnet.
Anmerkung: Peak-Cutting sorgt für eine Normalisierung der Elutionsprofile und zur Vermeidung von Elutions-Peak-Tailing, das Proteinaggregate enthalten kann.
- Waschen Sie die Säule mit drei CVs Äquilibrierungspuffer. Der Lauf endet nach dem Waschschritt.
- Nach der Elution wird das gereinigte Protein sofort mit 1 M Tris-Base auf einen pH-Wert von ~5,5 neutralisiert. Die Proteinkonzentration wird mit einem Mikrovolumen-UV-Vis-Spektralphotometer bei 280 nm und 260 nm gemessen und bei 4 °C gelagert.
