Ein Assay zur Messung des neutralisierenden Antikörpertiters, der spezifisch für das Respiratorische Synzytialvirus ist

Zusammenfassung

Quelle: Do, L. A. H., et al., Ein verbesserter und hoher Durchsatz für das Mikroneutralisationsassay des Respiratorischen Synzytialvirus (RSV).J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video zeigt einen Assay zur Messung von neutralisierenden Antikörpern gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV). Die Vorinkubation mit Serum, das RSV-neutralisierende Antikörper enthält, neutralisiert die Viruspartikel und reduziert so die Zellinfektion und die Plaquebildung. Virusinfizierte Zellen werden dann einer Fixierung, Blockierung und Fluorophor-konjugierten Antikörpermarkierung zur Visualisierung von Plaques unterzogen. Dieser Prozess ermöglicht die Identifizierung der höchsten Serumverdünnung, die fünfzig Prozent des RSV neutralisiert, was dem Neutralisationstiter entspricht.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer BSL2-Haube ausgeführt werden, sofern nicht anders angegeben. Vor einem Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRN) ist eine Virustitration erforderlich, um die optimale RSV-Konzentration zu bestimmen, die im PRN-Assay verwendet wird. Es wird empfohlen, die Virusbestände in einem kleinen Volumen zu aliquotieren, das einmal aufgetaut und für jeden NAb-Assay verwendet wird. Es wird ebenfalls empfohlen, für alle NAb-Assays denselben Virusbestand zu verwenden, der für alle Proben aus einer Studie durchgeführt wurde. Stellen Sie sicher, dass Nährmedien und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf 37 °C erwärmt werden, bevor Sie sie auf Zellplatten geben.

>1. RSV-Virus-Titration

HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der Virusbestände und der Anzahl der Duplikate kann die Assay-Platte gemäß Abbildung 1 eingerichtet werden. Jeder Virusstamm sollte in dreifacher Ausfertigung auf der Testplatte titriert werden, beginnend mit der höchsten Viruskonzentration (d. h. 1:10). Serielle Titrationen können typischerweise 1:10 betragen. A549-Zellkultur- und -erhaltungs- sowie RSV-Kulturverfahren werden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt und sind nicht in diesem Protokoll enthalten.

1. Säplatten (Tag 1)
   1. Resuspendieren Sie A549-Zellen in Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) + 10 % fötales Kälberserum (FCS) + 1000 IE Penicillin/Streptomycin (Pen/Streptokokken) bei 4 x 10⁵/ml. 96-Well-Sterilplatten mit flachem Boden und 100 μl/Well mit 4 x 10⁴ A459-Zellen ausseeden.
   2. Die Platten werden über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid (CO₂) inkubiert (die Zellen befinden sich in der logarithmischen Phase).
      Anmerkung: Verwenden Sie nach 23 Durchgängen ein neues A549-Zellfläschchen. Es wird empfohlen, die Experimente nicht zu beginnen, wenn sich noch ein neues Zellfläschchen an den ersten drei Durchgängen befindet.
2. Virusinfektion (Tag 2)
   1. Herstellung der seriellen Virusverdünnung
      1. Tauen Sie ein einzelnes gefrorenes Fläschchen mit dem Respiratorischen Synzytial-Virus (RSV) in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf, bis es fast vollständig aufgetaut ist, und stellen Sie es sofort auf Eis. Bereiten Sie 3 Replikate für jeden zu testenden RSV-Virusstamm vor, verwenden Sie eine anfängliche Virusstammverdünnung von 1:10 mit 100 μl verdünntem Virus/Vertiefung und reservieren Sie mindestens eine Säule für die Negativkontrolle.
         HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Negativkontrolle in dreifacher Ausfertigung.
      2. Geben Sie 100 μl jedes verdünnten Virus im Verhältnis 1:10 in dreifacher Ausfertigung von Reihe A einer sterilen 96-Well-Platte mit U-Boden hinzu. 90 μl/Vertiefung DMEM + 1000 I.E. Pen/Streptokokken ohne FCS in die Reihen B bis H geben.
      3. Führen Sie serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:10 auf der Platte durch, indem Sie 10 μl von Reihe A in Reihe B übertragen. Mischen Sie die Lösung, indem Sie den Inhalt 5 Mal auf und ab pipettieren und die zehnfachen Verdünnungen bis Reihe H fortsetzen. Verwerfen Sie die letzten 10 μl, so dass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung 90 μl beträgt< br /> HINWEIS: Es ist wichtig, für jede Verdünnung neue Spitzen zu verwenden.
   2. Virusinokulation in A549-Zellen
      1. Entnahme der am Vortag vorbereiteten A549-Zellplatte(n). Stellen Sie sicher, dass die A549-Zellmonoschichten in den 96-Well-Platten zu ~80 % konfluent sind. Entsorgen Sie das Medium, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf einem sterilen, saugfähigen Papiertuch abtupfen.
      2. Waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit 100 μl PBS. Entsorgen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und nach jedem Waschen leicht auf einem sterilen, saugfähigen Papiertuch abtupfen. Lassen Sie die Platten nicht trocknen.
      3. Übertragen Sie die Virusverdünnungen von der viralen Titrationsplatte (Abbildung 1) in die entsprechenden Vertiefungen auf der A549-Zellplatte. Die Platte 1 h bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren. Nach 1 Stunde Inkubation die Überstände mit einer Pipette dekantieren (um eine Kreuzkontamination zu vermeiden). 90 μl/Vertiefung herausnehmen.
      4. In jede Vertiefung werden 100 μl 1x Medium 199 (M199, siehe Materialtabelle) + 1,5 % Carboxymethylcellulose-Natriumsalz (CMC) mit niedriger Viskosität + 2 % FCS, das Pen/Streptokokken enthält, gegeben.
         HINWEIS: 2x M199 + 4 % FCS + 2 % Pen/Streptokokken und 3 % CMC-Lösungen müssen für die zukünftige Verwendung vorbereitet und bei 4 °C gelagert werden. Stellen Sie sicher, dass die Lösung auf 37 °C erwärmt ist, bevor Sie sie auf die Platten geben.
         1. Bereiten Sie 2x M199-Lösung vor: 1 Beutel/500 mL destilliertes Wasser + 20 mL FCS + 10 mL Pen/Streptokokken (zur Herstellung von 2x MI99). Filtrieren Sie die Lösung mit einer 0,22 μm Filtereinheit.
         2. Für die Zubereitung von 3% CMC 15 g CMC langsam in 500 mL destilliertes Wasser geben. Lösen Sie das CMC mit einem metallischen Rührerhitzer bei 50 °C in Wasser auf, dessen Zubereitung etwa 1 Stunde dauert. Gut mischen, um 3% CMC herzustellen, und die Lösung autoklavieren.
            HINWEIS: Der CMC-Feststoff muss dem aufzulösenden Wasser zugesetzt werden. Durch die Zugabe von Wasser zum trockenen Feststoff entsteht ein "Klumpen" aus Feststoff, der sich nur sehr schwer auflösen lässt.
         3. 1x M199 + 1,5 % CMC niedrigviskos + 2 % FCS mit Pen/Streptokokken werden hergestellt, indem die in Schritt 1.2.2.4.2 hergestellten 2x M199 und 3 % CMC 1:1 gemischt werden.
      5. Die Platte 3 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubieren.
3. Entwicklung der Assay-Platte und Analyse (Tag 5)
   1. Fixierung und Entwicklung einer Assay-Platte
      1. M199 + CMC + 2 % FCS, der Stift/Streptokokken enthält, durch vorsichtiges Umdrehen der Platte entsorgen. Geben Sie langsam (um eine Störung der Zellschicht zu vermeiden) 200 μl Fixierungspuffer (80 % Aceton, 20 % PBS, gelagert bei -20 °C), um die Zellen zu fixieren. Inkubieren Sie bei -20 °C für 20 min.
      2. Entsorgen Sie den Fixierpuffer und tupfen Sie ihn vorsichtig auf ein saugfähiges Papiertuch. Lassen Sie die Platte mit der Vorderseite nach unten 10 Minuten trocknen.
         Anmerkung: Ab diesem Schritt kann der Assay außerhalb der BSL2-Haube durchgeführt werden.
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      3. %ige Milchverdünnungslösung in filtriertem PBS mit 0,05 % Polysorbat 20 (PBS-Polysorbat, siehe Materialtabelle) herstellen. Berechnen Sie das für die Blockierung benötigte Volumen für eine Platte basierend auf 200 /Vertiefung und 110 Vertiefungen: 200 μl/Vertiefung x 110 Vertiefungen = 22 mL (1,1 ml konzentriertes Milchverdünnungsmittel in 20,9 ml gefiltertem PBS-Polysorbat). In diesem Stadium ist auch eine ausreichende Blockierungslösung für Primär- und Sekundärantikörper herzustellen. Berechnen Sie das Volumen, das für jede Antikörperlösung für eine Platte auf der Grundlage von 50 μl/Well und 110 Wells benötigt wird: 50 μL/Well x 110 Wells = 5,5 mL. Daher beträgt das Gesamtvolumen der Milchverdünnungsblockierungslösung, die für einen Einzelplatten-Assay erforderlich ist, 33 ml.
      4. Fügen Sie 200 μl/Vertiefung Blockierungslösung hinzu. Die Platte bei Raumtemperatur (RT) 30 min inkubieren. Entsorgen Sie die Lösung, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und auf ein saugfähiges Papiertuch tupfen.
      5. Bereiten Sie 1:500 Goat X RSV-Antikörper (mAb – Primärantikörper) in Blockierungslösung verdünnt vor. 50 μl/Vertiefung der mAb-Lösung zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie den Teller 3 Mal mit gefiltertem PBS-Polysorbat.
      6. Bereiten Sie 1:5.000 Alexa-Fluor Esel Anti-Ziegen-IgG (Sekundärantikörper) in Blockierungslösung verdünnt vor. 50 μl/Vertiefung der Sekundärantikörperlösung zugeben und 1 h bei 37 °C inkubieren. Waschen Sie den Teller 5 Mal mit gefiltertem PBS-Polysorbat.
      7. Lesen Sie die Platte auf einem automatischen Spot-Reader mit den Kanal- und Zähleinstellungen des Fluoresceinisothiocyanats (FITC) ab, wie in Abbildung 2 gezeigt. Wickeln Sie die Platte in Folie ein und lagern Sie sie bei 4 °C. Kalibrieren Sie das Gerät mit einer unbenutzten 96-Well-Kulturplatte und geben Sie die Zähleinstellungen vor dem Assay ein.
         Anmerkung: Ein erneutes Scannen innerhalb weniger Tage ist bei Bedarf möglich. Die Kalibrierungs- und Zähleinstellung kann gespeichert und für zukünftige Scanvorgänge verwendet werden, wenn für den Assay derselbe Plattentyp verwendet wird, der für die Kalibrierung verwendet wurde.
      8. Überprüfen Sie die Bilder der Vertiefungen auf Artefaktplaques oder zerbrochene Zellmonoschichten (Abbildung 3). Vertiefungen mit gestörten Zellmonoschichten ausschließen.
         Anmerkung: Abhängig von der Größe der Artefakttafeln müssen möglicherweise manuelle Zählungen für diese Vertiefungen durchgeführt werden, oder diese Vertiefungen müssen aus der Datenanalyse verworfen werden. Zu den Kriterien für ein valides Ergebnis gehört, dass keine gestörten Zell-, Monolayer- oder Artefakt-Plaques in mehr als einem Replikat-Well nachgewiesen wurden und dass keine plaquebildenden Einheiten (PFU) in negativen Wells (Wells ohne zugesetztes Virus) nachgewiesen wurden.
   2. Bestimmung der Viruskonzentrationen
      1. Wählen Sie die letzten beiden Verdünnungen, bei denen die Flecken eindeutig gezählt werden können. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl von Spots aus Replikat-Wells bei gleicher Verdünnung. Berechnen Sie den Virustiter (PFU pro ml) der Stammprobe mit der folgenden Formel:
         PFU/ml = Durchschnittliche Anzahl von Plaques/(Verdünnungsfaktor × Volumen des verdünnten Virus, das der Vertiefung zugesetzt wurde)
         Anmerkung: Die für jeden RSV-Stamm ermittelte Viruskonzentration kann nun im PRN-Assay (Schritt 2) verwendet werden.

>2. RSV-Neutralisations-Assay

1. Säplatten (Tag 1)
   1. Resuspendieren Sie A549-Zellen in DMEM + 10 % FCS + 1000 IE Pen/Streptokokken bei 4 x 10⁵/ml. 96-Well-Platten mit flachem Boden und 100 μl/Well, die 4 x 10⁴ A459-Zellen enthalten, aussäen und über Nacht bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren (die Zellen befinden sich in der logarithmischen Phase).
      Anmerkung: Verwenden Sie nach 23 Durchgängen ein neues A549-Zellfläschchen. Es wird nicht empfohlen, A549-Zellen vor Passage Nummer 3 zu verwenden.
2. Virus- und Serumvorbereitung (Tag 2)
   Anmerkung: Je nach Probentyp gibt es erforderliche Schritte für die Vorbehandlung von Proben vor dem NAb-Assay. Es wird empfohlen, die internationalen RSV-Standardseren zu verwenden, die jetzt auf Anfrage beim National Institute for Biological Standards and Controls (NIBSC) erhältlich sind.
   1. Vorbereitung der Serumverdünnung
      1. Tauen Sie das humane RSV-Referenz-Antiserum (Referenzserum, REF) und die Serum-Testproben bei RT auf. Hitzeinaktivierte Serumproben und Referenz-Antiserum vor der Verwendung 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 56 °C auftauen. Bereiten Sie die Verdünnungen gemäß der Plattenschablone vor (Abbildung 4).
      2. Bereiten Sie eine Verdünnung des REF im Verhältnis 1:100 vor. Bereiten Sie mindestens 110 μl REF vor, verdünnt in DMEM + Pen/Streptokokken ohne FCS pro Assay-Platte (z. B. 1,5 μl REF bei einem Gesamtvolumen von 150 μl). Geben Sie 110 μl 1:100 verdünntes REF in die Vertiefung A12 einer sterilen 96-Well-Platte mit U-Boden.
      3. 55 μl DMEM + Stift/Streptokokken ohne FCS werden in die Vertiefungen B12 bis H12 in Spalte 12 gegeben. Führen Sie serielle 1:2-Verdünnungen auf der Platte durch, indem Sie 55 μl von Reihe A in Reihe B übertragen, die Lösung mischen, indem Sie den Inhalt 5 Mal auf und ab pipettieren und bis Reihe H fortsetzen. Entsorgen Sie die letzten 55 μl des Mediums, so dass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung 55 μl beträgt. Verwenden Sie für jede Verdünnung neue Spitzen.
      4. Bereiten Sie eine Verdünnung von Serumtestproben im Verhältnis 1:100 vor. Da alle Serumproben in dreifacher Ausfertigung untersucht werden, ist ein Mindestvolumen von 110 μl/Vertiefung x 3 = 330 μl pro Serumtestprobe vorzubereiten.
      5. Geben Sie 110 μl jeder verdünnten Serumtestprobe hinzu (1:100; S1 = Serum 1, S2 = Serum 2, etc.) in die entsprechenden Vertiefungen A1 bis A9 und auch E1 bis E9 der sterilen 96-Well-Platte gemäß Figur 4.
      6. 55 μl DMEM + Pen/Streptokokken ohne FCS in alle mit X gekennzeichneten Vertiefungen geben. Serielle 1:2-Verdünnungen gemäß Schritt 2.2.1.3 bis Zeile D (für die Proben 1, 2 und 3) durchführen. Verwerfen Sie die letzten 55 μl des Mediums, sodass das endgültige Volumen in jeder Vertiefung 55 μl beträgt. Führen Sie auf ähnliche Weise die seriellen 1:2-Verdünnungen für die Proben 4, 5 und 6 für die Zeilen E bis H.
         durch Anmerkung: Es ist wichtig, für jede Verdünnung neue Spitzen zu verwenden.
      7. 55 μl DMEM + Stift/Streptokokken ohne FCS werden in die Vertiefungen in den Spalten 10 und 11 gegeben.
   2. Vorbereitung des Virus
      1. Tauen Sie ein einzelnes gefrorenes Fläschchen mit RSV in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell auf, bis es fast vollständig aufgetaut ist, und stellen Sie es sofort auf Eis.
      2. Verdünntes Virus in DMEM + Pen/Streptokokken ohne FCS basierend auf der in Schritt 1.3.2 bestimmten Konzentration des RSV-Aliquots. Tragen Sie eine Verdünnung auf, die ca. 200 PFU/Well ergibt. Bereiten Sie ein Gesamtvolumen von 5,5 mL vor (für 100 Wells).
   3. Herstellung einer Virus-Serum-Mischung
      1. Geben Sie 55 μl des verdünnten Virus in alle Vertiefungen der Spalten 1 bis 9 und in die Vertiefungen der Zeilen E-H der Spalten 10 und 11 (Positivkontrolle) gemäß der Plattenvorlage (Abbildung 4).
      2. 55 μl DMEM + Pen/Streptokokken ohne FCS in alle Vertiefungen der Zeilen A-D der Spalten 10 und 11 geben (Negativkontrolle). Die Platte 1 h bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
   4. Virusinokulation in A549-Zellen
      1. Vor Ablauf der Inkubationszeit sind die in Schritt 2.1.1 vorbereiteten A549-Zellplatten zu entnehmen. Stellen Sie sicher, dass die A549-Zellmonoschichten in den 96-Well-Platten zu ~80 % konfluent sind.
      2. Entsorgen Sie das Medium, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und leicht auf einem sterilen, saugfähigen Papiertuch abtupfen. Waschen Sie alle Vertiefungen zweimal mit 100 μl PBS, entsorgen Sie überschüssiges PBS, indem Sie die Platte vorsichtig umdrehen und nach jedem Waschen leicht auf ein steriles, saugfähiges Papiertuch tupfen. Lassen Sie die Platten nicht trocknen.
      3. Übertragen Sie 100 μl/Vertiefung des Virus-Serum-Gemisches gemäß der Plattenvorlage in die entsprechenden Vertiefungen auf der A549-Zellplatte. Die Platte 1 h bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubieren.
      4. Nach 1 h mit einer Pipette 90 μl/Vertiefung herausnehmen und 100 μl vorgewärmtes 1x M199 + 1,5 % CMC + 2 % FCS + Stift/Streptokokken hinzufügen. Inkubationsplatte für 3 Tage bei 37 °C, 5 % CO₂,
         Anmerkung: Stellen Sie sicher, dass die Lösung auf 37 °C erwärmt wird, bevor Sie sie auf die Platten geben.
3. Entwicklung der Assay-Platte und Analyse (Tag 5)
   1. Entwicklung einer Fixierungs- und Assay-Platte gemäß den Schritten 1.3.1.1 bis 1.3.1.8.
   2. Bestimmen Sie den 50%igen Neutralisationstiter
      1. Bestimmen Sie den 50%igen Neutralisationstiter, indem Sie den proportionalen Abstand zwischen den reziproken Serumverdünnungen über und unter 50% der Kontrollvertiefungen ohne Serum berechnen (positive Viruskontrolle - Spalte 10, Zeilen E-H).
      2. Zählen Sie die Anzahl der PFU (d. h. Plaques), die durch einzelne Virusinfektionen in Serumvertiefungen und ohne Serumkontrollvertiefungen entstehen. Berechnen Sie die mittlere Anzahl der PFU der Kontrollvertiefungen ohne Serum und bestimmen Sie den 50%-Wert.
      3. Identifizieren Sie Serumverdünnungen mit Werten unmittelbar über und unter dem 50 %-Wert der Kontrollwells ohne Serum. Zeichnen Sie mithilfe eines Semi-Log-Diagramms oder einer Tabellenkalkulationsvorlage die Anzahl der PFU auf der x-Achse (lineare Skala) und die reziproke Serumverdünnung auf der y-Achse (logarithmus₁₀ Skala) auf. Ziehen Sie eine Linie zwischen den beiden Punkten und lesen Sie aus dieser Linie die 50%igen Neutralisationstiter der Testserumproben ab.

Ergebnisse

Abbildung 1: Layout der viralen Titrationsplatte für die Quantifizierung von RSV-Aktien.v = Bestand an RSV-Viren (v1, Bestand an Viruscharge 1; v2, Bestand an Viruscharge 2; v3, Bestand an Viruscharge 3), N = Vertiefung der Negativkontrolle, X = zugesetztes Medium. Die Farbcodierung dient nur dazu, die Visualisierung des Plattenlayouts zu unterstützen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zelllinie
Nr. A549	ATCC	CCL-185	zur Verfügung gestellt von Dr. Keith Chappell, University of Queensland
Virusstämme
RSV A2	ATCC	VR-1540	Losnummer 60430286
reagenzien
Aceton	Merck	1000142511
Alexa-Fluor Esel Anti-Ziegen-IgG (gelagert bei 4 °C)	Lebenstechnologien	Nr. A11055
CMC Natriumsalz Pulver	Sigma-Aldrich	C5678-500G
DMEM (ohne Serum, 3,7 g/L NaHC, P/S) (gelagert bei 4 °C)	Wissenschaftliche Dienstleistungen – Gewebekultur		MCRI in der Hausversorgung
Fötales Kälberserum (gelagert in 50 ml Aliquoten bei -20 °C)	Zwischenweg	SFBS-F
Ziege X RSV Antikörper	Merck	AB1128
Humanes polyklonales Antiserum gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) (gelagert in 45 μl Aliquoten bei -20 °C)	BEI Ressourcen	NR-4022	Kostenlose Bestellung über BEI Resources bei der Registrierung. Dieses Serum gehört zu einer Reihe von humanen Antiserum und Immunglobulin gegen RSV (NR-32832)
M199 Pulver	Lebenstechnologien	31100035
Verdünnungslösung für Milch (gelagert bei 4 °C)	Australische Bioforschung	Artikel-Nr.: 50-82-01
Penicillin/Streptomycin (gelagert in 6 ml Aliquoten bei -20 °C)	Lebenstechnologien	15140122
s.d.H2O aus Milli-Q Dispenser	Merck		Inhouse-Dispensation
Steril 1X PBS für die Kultur (gelagert bei 4 °C)	Wissenschaftliche Dienstleistungen – Gewebekultur		MCRI in der Hausversorgung
Tween 20 Polysorbat	Sigma-Aldrich	Artikel-Nr.: 9005-64-5
Allgemeine Verbrauchsmaterialien
Konische Falcon-Röhrchen (50 mL)	Invitro-Technologien	FAL352070
Filtereinheit 0,22 μm (500 mL)	Thermo Fischer	NAL5660020
Sterile Eppendorf-Röhrchen (1,5 mL)	Australien PL	AM12400
Sterile Platten mit flachem Boden (96 Well mit Deckel)	Zwischenweg	Artikel-Nr.: 655180
Sterile U-Bodenplatten (96-Well-Platten mit Deckel)	Zwischenweg	Artikel-Nr.: 650180
5 ml serologische Pipette	Sigma-Aldrich	CLS4487-200EA
10 mL serologische Pipette	Zwischenweg	Artikel-Nr.: 607180
25 mL serologische Pipette	Sigma-Aldrich	CLS4251-200EA
Spitze Pipette 1-200 μL Klar Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-200-L-R-S
Spitze Pipette 5-20 μL Klar Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 96TIPS PKG960	Fisher Biotec	TF-20-L-R-S
Spitzenpipette 100-1000 μLClear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1000	Fisher Biotec	TF-1000-L-R-S
Tip-Pipette 1-10 μL Clear Maxymum Recovery Racked Vorsterilisiert 10RACKS x 100TIPS PKG1001	Fisher Biotec	TXLF-10-L-R-S
Ausrüstungen und Software
ELISpot Lesesystem	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Straßburg, Deutschland
AID ELISpot Software Version 5.0	AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Straßburg, Deutschland
Microsoft Excel 2007