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Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Vorbereitung des Puffers
- Markierungspuffer (2x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,9): In 400 mL destilliertem deionisiertem (DD) Wasser 100 mL 10x PBS zugeben, pH-Wert auf 7,9 mit Natriumhydroxid (NaOH) einstellen.
- 3 mM Biotin: 1 mg Biotin in 588 μl Markierungspuffer lösen.
- 3 mM Sulfo-Tag: 150 nmol Sulfo-Tag werden in 50 μl Markierungspuffer gelöst.
- Antigenpuffer (5% BSA): In 500 ml 1x PBS fügen Sie 25 g Rinderserumalbumin (BSA) hinzu.
- 0,5 M Essigsäurelösung herstellen.
- 1,0 M Tris-HCl-Puffer pH 9,0: Bereiten Sie 1 M Tris-HCl-Puffer vor und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 9,0 ein.
- Beschichtungspuffer (3% Blocker A): In 500 mL 1x PBS 15 g Blocker A zugeben.
- Waschpuffer (0,05 % Tween 20, PBST): In 5000 mL 1x PBS 2,5 mL Tween 20 zugeben.
- Lesepuffer (2x Read Buffer T mit Tensid): In 500 mL DD-Wasser 500 mL 4x Read Buffer T mit Tensid geben (Tabelle der Materialien).
- Biotin und Sulfo-Tag in einem -20 °C Gefrierschrank lagern.
Anmerkung: Sowohl Biotin- als auch Sulfo-Tag-Lösungen sollten immer kurz vor dem Markierungsverfahren frisch zubereitet werden.
>2. Markierung des Autoantigens der menschlichen Insel mit Biotin und Sulfo-Tag
HINWEIS: Eine hohe Antigenkonzentration von ≥0,5 mg/ml wird für eine effizientere Markierungsreaktion empfohlen.
- Bestimmung des molaren Verhältnisses des humanen Inselautoantigens für Biotin und Sulfo-Tag.
- Ermitteln Sie die molare Anzahl des Antigens, indem Sie das Antigengewicht durch das Molekulargewicht dividieren.
- Verwenden Sie das molare Verhältnis von 1:5 für das Antigen mit kleinerem Molekulargewicht (≤10 kd) und das molare Verhältnis von 1:20 für das Antigen mit größerem Molekulargewicht (>50 kd).
- Berechnen Sie das Volumen für Biotin oder Sulfo-Tag, indem Sie die Molzahl durch ihre Konzentration dividieren.
- Mischen Sie das humane Insel-Autoantigen mit Biotin oder Sulfo-Tag mit dem molaren Verhältnis von 1:5,
Anmerkung: Das Protein in Tris- oder Glycin-Puffersystemen sollte mit Hilfe der Sizing Spin Säule gegen 2x PBS-Puffer mit pH 7,9 ausgetauscht werden.
- Da Biotin und Sulfo-Tag lichtempfindlich sind, decken Sie die Reaktionsgefäße mit Alufolie ab. Die Reaktion wird 1 h lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.
- Während der Inkubation wird die Spin-Säule vorbereitet, indem dreimal 2x PBS-Puffer in die Säule gegeben wird. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1000 x g für jeweils 2 Minuten.
Anmerkung: Derzeit findet die Markierungsreaktion durch Bridging immer noch statt und muss gestoppt werden.
- Stoppen Sie die Markierungsreaktion, indem Sie das markierte Autoantigen der menschlichen Insel reinigen. Zur Reinigung wird das Autoantigen durch die Spin-Säule geleitet und die Säule bei 1000 x g für 2 min zentrifugiert.
- Bestimmen Sie die markierte Antigenkonzentration (μg/μL) anhand der Menge des Antigenproteins und des Endvolumens.
Anmerkung: Ungefähr gibt es nach jedem Durchgang der Spin-Säule eine Retention von 90 - 95% des markierten Antigens.
- Aliquotieren Sie das markierte Antigen und lagern Sie das markierte Antigen bei -80 °C.
>3. Definieren Sie die besten Konzentrationen und Verhältnisse für die beiden markierten Antigene für den Assay (Checker-Board-Assay)
- Bereiten Sie zwei Serumproben vor, eine hochpositive und eine negative mit einem Gesamtvolumen von jeweils 200 μl.
- Aliquotieren Sie 4 μl Serum und fügen Sie 1x PBS hinzu, bis das endgültige Volumen 20 μl pro Vertiefung für eine 96-Well-Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Platte beträgt. Verwenden Sie die Hälfte einer Platte für die stark positive Probe und die andere Hälfte für die negative Probe, wie in Abbildung 1A dargestellt.
- Fügen Sie 10 μl Biotin und 10 μl Sulfo-Tag-markiertes Antigen hinzu und führen Sie serielle Verdünnungen für die beiden unterschiedlich markierten Antigene durch, wie in Abbildung 1A gezeigt. Führen Sie eine horizontale serielle Verdünnung für ein markiertes Antigen und eine vertikale serielle Verdünnung für das andere markierte Antigen durch.
- Die restlichen Untersuchungsschritte werden in den Nummern 5.3 bis 9.1 fortgesetzt.
- Berechnen Sie das Verhältnis der Signale aus der hohen positiven Probe zu jedem der entsprechenden Signale aus der negativen Stichprobe, die in Abbildung 1B gezeigt ist.
- Identifizieren Sie die besten Konzentrationen für Biotin- und Sulfo-Tag-markierte Antigene, indem Sie einen Punkt mit dem höchsten oder nahezu höchsten Verhältnis von positiv zu negativ auswählen. Berücksichtigen Sie das geringe Hintergrundsignal der negativen Probe, um das Verhältnis zu identifizieren.
Anmerkung: Assay-Tag 1 umfasst die Schritte 4 bis 6.
>4. Bereiten Sie den Antigenpuffer mit der richtigen Konzentration von Biotin/Sulfo-Tag-markiertem Antigen
vor
- Wählen Sie die rationale Konzentration jedes Antigens basierend auf dem Schachbrett-Assay aus.
- Bereiten Sie 3 ml Antigenlösung pro Platte vor, wobei die rationale Konzentration des Biotin/Sulfo-Tag-markierten Antigens für den Antigenpuffer verwendet wird.
>5. Inkubieren von Serumproben mit markiertem Antigen
HINWEIS: Es gibt zwei Protokolle in diesem Abschnitt, eines ohne Serumsäurebehandlung und eines mit Serumsäurebehandlung. Alle Insel-Autoantikörper-Assays mit Ausnahme des Insulin-Autoantikörpers (IAA)-Assays verwenden ein reguläres Protokoll ohne Serumsäurebehandlung von den Schritten 5.1 bis 5.5, während der IAA-Assay diese Schritte überspringt und das Protokoll mit der Serumsäurebehandlung von den Schritten 5.6 bis 5.9 verwendet.
- Aliquotieren Sie 4 μl Serum und fügen Sie 1x PBS hinzu, bis das endgültige Volumen 20 μl pro Well für eine 96-Well-PCR-Platte beträgt.
- Fügen Sie 20 μl markierte Antigenlösung pro Vertiefung hinzu.
- Decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu vermeiden.
- Stellen Sie die Platte für 2 h auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT
.
- Die Platte in den 4 °C Kühlschrank stellen und über Nacht (18 - 24 h) inkubieren.
Anmerkung: Das folgende Protokoll der Schritte 5.6 bis 5.9 ist nur für IAA-Assays konzipiert, und andere Autoantikörper-Assays überspringen diese Schritte.
- Mischen Sie 15 μl Serum mit 18 μl 0,5 M Essigsäure für jede Serumprobe. Inkubieren Sie diese Mischung 45 Minuten lang bei RT.
- Bereiten Sie die Antigenlösung mit der rationalen Konzentration von Biotin und Sulfo-Tag-markiertem Antigen vor, basierend auf dem Schachbrett-Assay, unter Verwendung von Antigenpuffer. In jeder Vertiefung aliquotieren Sie 35 μl Antigenpuffer, der Biotin und Sulfo-Tag-markiertes Antigen enthält, in eine neue PCR-Platte.
- Bevor der 45-minütige Inkubationsschritt (Schritt 5.6) abgeschlossen ist, geben Sie 8,3 μl 1 M Tris pH 9,0 Puffer an die Seite jeder Vertiefung auf die Antigenplatte (Schritt 5.6). Es ist wichtig, die Vermischung zwischen dem Tris-Puffer und dem Antigen zu begrenzen. Sofort 25 μl des Serums, das in Schritt 5.6 mit Säure behandelt wird, in jede Vertiefung geben und die Lösung umrühren. Decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab, um Licht zu vermeiden.
- Stellen Sie die Platte für 2 h auf einen Shaker (niedrige Geschwindigkeit) bei RT. Stellen Sie die Platte in den 4 °C Kühlschrank und lassen Sie die Platte über Nacht (18 - 24 h) inkubieren.
>6. Bereiten Sie die Streptavidin-Platte vor
- Nehmen Sie eine Streptavidin-Platte aus dem 4 °C Kühlschrank und lassen Sie die Platte auf RT kommen.
- Sobald sich die Streptavidin-Platte bei RT befindet, geben Sie 150 μl 3 % Blocker A in jede Vertiefung
.
- Decken Sie die PCR-Platte mit Siegelfolie ab.
- Die Platte über Nacht im 4 °C heißen Kühlschrank inkubieren lassen.
HINWEIS: Assay-Tag 2 umfasst die Schritte 7 bis 9.
>7. Serum/Antigen-Inkubate auf die Streptavidin-Platte übertragen
- Nehmen Sie am nächsten Tag die Streptavidin-Platte aus dem Kühlschrank und entsorgen Sie den Puffer von der Platte. Lege ein paar trockene Papiertücher auf den Tisch und klopfe den Teller auf den Kopf, bis kein Puffer mehr in den Vertiefungen ist.
- Füllen Sie die leere Streptavidin-Platte mit 150 μl PBST pro Vertiefung und entsorgen Sie das PBST für insgesamt drei Wäschen von der Platte.
- Übertragen Sie 30 μl Serum/Antigen-Inkubaten pro Vertiefung in die Streptavidin-Platte.
- Decken Sie die Platte mit Folie ab, um Licht zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte auf niedriger Stufe bei RT 1 Stunde lang.
>8. Waschen Sie die Platte und fügen Sie Lesepuffer hinzu
- Inkubationsgegenstände von der Platte entsorgen. Fügen Sie 150 μl PBST pro Vertiefung hinzu und entsorgen Sie das PBST für insgesamt drei Wäschen von der Platte.
- Nach dem Waschen 150 μl pro Vertiefung Lesepuffer hinzufügen.
Anmerkung: Es ist wichtig, Luftblasen in der Lösung zu vermeiden, da dies die Art und Weise beeinflusst, wie die Platte auf dem Plattenlesegerät gelesen wird.
