Ein papierbasierter Immunoassay zum Nachweis von Immunglobulin G

Zusammenfassung

Quelle: Peng, Y. et al., Kovalente Bindung von Antikörpern an Zellulosepapierscheiben und ihre Anwendungen in kolorimetrischen Immunoassays mit bloßem Auge.J. Vis. Exp. (2016)

Das Video zeigt einen papierbasierten Immunoassay, bei dem aminfunktionalisierte Zellulosescheiben mit Glutaraldehyd vernetzt sind. Die kovalente Immobilisierung von IgG-Fc-spezifischen Capture-Antikörpern, gefolgt von der Einführung von Immunglobulin G und Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Detektionsantikörpern, führt zu einer Farbveränderung, die das Vorhandensein von Immunglobulin G bestätigt.

Protokoll

>1. Veredelung von funktionellen Amingruppen auf Zellulosepapierscheiben

1. Bereiten Sie ein Blatt quadratisches Papier mit einer Abmessung von 1 cm × 1 cm und 100 Papierscheiben aus Zellulosepapier der Güteklasse Nr. 1 mit einem Durchmesser von 6,0 mm (Filterpapier mit mittlerem Durchfluss) mit einem Locher vor.
2. Zur Ableitung von -NH_2-Gruppen auf den Papierscheiben mischen Sie 1 ml 3-Aminopropyltrimethoxysilan (APS) und 10 ml Aceton in einer 50-ml-Glasflasche im Abzug. Legen Sie Papierscheiben in die frisch zubereitete APS-Reagenzmischung und inkubieren Sie sie 5 Stunden lang unter Orbitalrühren (200 U/min) bei Raumtemperatur.
   Vorsicht: Umgang mit APS und Aceton im Abzug.
3. Überschüssige Lösung aus der 50 ml Glasflasche in einen Bioabfallbehälter umfüllen.
4. 10 ml Aceton in die Glasflasche geben, gut mischen und vollständig dekantieren, um nicht umgesetztes APS und andere Verunreinigungen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
5. Die Papierscheiben auf dem Papiertuch verteilen und für 3 Std. in den bei 110 °C warmen Ofen schieben. Die Papierscheiben abkühlen lassen. Lagern Sie die Discs in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen bei Raumtemperatur.
6. Verwenden Sie die Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), um die Veredelung von Amingruppen auf dem quadratischen Zellulosepapier zu überprüfen, wie unten beschrieben (Abbildung 1A).
   1. Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie das FTIR-Spektroskopiegerät.
   2. Öffnen Sie die Software für die FTIR-Spektroskopie.
   3. Gehen Sie zu 'Messung → Initialisierung'. Die Rechtecke für 'BS: KBr', 'Lampe: Infrarot' und 'Laser' werden grün, wenn die Initialisierung abgeschlossen ist.
   4. Wählen Sie unter den Rechtecken "Daten" und wählen Sie "%Transmission", "Happ-Genzel", "45", "4.0" und "Min: 400, Max: 4000" für "Messmodus", "Apodisierung", "Anzahl der Scans", "Auflösung" und "Bereich (cm-1)".
   5. Klicken Sie auf "Messen".
   6. Wählen Sie "Datendatei" für die Hintergrunddaten. Schreiben Sie die Kommentare auf.
   7. Klicken Sie auf 'BKG', um die Baseline für den Hintergrund zu erhalten.
   8. Befestigen Sie das quadratische Papier auf dem Filmprobenhalter.
   9. Wählen Sie "Datendatei" für die Beispieldaten. Schreiben Sie die Kommentare auf.
   10. Klicken Sie auf "Probe", um die Spektren für die Probe zu erhalten.
   11. Schließen Sie die FTIR-Spektroskopie-Anwendung, und schalten Sie den Computer aus.
7. Wiederholen Sie die obigen Schritte (Schritte 1.1 bis 1.6), um aminfunktionalisiertes quadratisches Zellulosepapier und -scheiben der Sorte Nr. 113 (Schnellflussfilterpapier) herzustellen und die FTIR-Spektren für das quadratische Papier der Sorte Nr. 113 zu erhalten (Abbildung 1B).

>2. Papierbasierter Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) für den Nachweis von Immunglobulin G (IgG)

1. 5 ml 0,05%ige Glutaraldehydlösung (hergestellt in 50 mM PBS-Puffer, pH 7,4) in eine 20-ml-Glasflasche geben. Tauchen Sie 15 aminfunktionalisierte Filterpapierscheiben mit mittlerem Durchfluss in diese Lösung und halten Sie sie 1 Stunde lang unter Schütteln bei Raumtemperatur.
   1. Wiederholen Sie gleichzeitig Schritt 2.1, um weitere 15 aldehydfunktionalisierte Schnellstromfilter-Papierscheiben vorzubereiten.
      Vorsicht: Verarbeiten Sie Glutaraldehyd im Abzug.
2. Um nicht umgesetztes Glutaraldehyd von den Papierscheiben zu entfernen, legen Sie die 15 Filterpapierscheiben mit mittlerem Durchfluss in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und die 15 Papierscheiben mit schnellem Durchfluss in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 5 ml DI-Wasser in jedes Röhrchen und schütteln Sie die Röhrchen 10 Sekunden lang. Entfernen Sie das Wasser, indem Sie es mit einer Pipette aspirieren. Wiederholen Sie dies zweimal, um nicht umgesetztes Glutaraldehyd zu entfernen.
3. Trocknen Sie die Papierscheiben im 37 °C heißen Backofen.
4. Geben Sie 5 μl und 8 μl 0,025 mg/ml Maus-IgG-Fc-Fragment-Antikörper auf jede der Papierscheiben mit mittlerem bzw. schnellem Durchfluss und inkubieren Sie 20 Minuten lang.
5. Geben Sie 10 μl 50 mM PBS (pH 7,4) auf jede Papierscheibe, ohne die Antikörper zu entfernen, und inkubieren Sie 40 Minuten lang für die Aminaldehydreaktion.
6. Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.
7. Die Papierscheiben im Backofen bei 37 °C trocknen.
8. Blockieren Sie die Papierscheiben mit 15 μl Blockierpuffer für 10 min bei Raumtemperatur.
9. Waschen Sie jede Papierscheibe mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.
10. Führen Sie IgG-Standards aus.
    1. Laden Sie 10 μl verschiedener IgG-Konzentrationen (z. B. 0, 10, 125, 250 und 500 ng/ml in PBS) in dreifacher Ausfertigung auf jede Platte. 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren.
11. Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.
12. Laden Sie 10 μl HRP-konjugierte Maus-IgG-Fc-Fragment-Antikörper (1:10.000, 10 mM PBS, pH 7,4) und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur.
13. Waschen Sie die Papierscheiben mit 0,2 ml Waschpuffer auf einem Papiertuch. Wiederholen Sie den Waschgang dreimal.
    Anmerkung: Es ist nicht notwendig, den Waschpuffer zu entfernen, da die Ergebnisse durch das Vorhandensein des Puffers nicht beeinflusst werden.
14. Laden Sie eine 10-μl-Mischung aus TMB und Wasserstoffperoxid auf jede Scheibe.
15. Fotografieren Sie alle Papierdiscs mit einer Digitalkamera oder einem Smartphone nach 5 Minuten Inkubation.
    Anmerkung: In Abbildung 2A steht "0" für Papierscheiben, die mit einer Immobilisierung als Fängerantikörper behandelt wurden, und für die Antikörper-HRP/TMB-Lösung ohne IgG-Serum.
16. Analysieren Sie die Intensität jeder Papierscheibe im Bild mit Bild J.
    1. Konvertieren Sie die in Schritt 3.15 aufgenommenen Bilder in das Format '.tif'.
    2. Öffnen Sie die Software 'Image J'.
    3. Gehen Sie zu "Datei → Öffnen" und wählen Sie das zu analysierende Bild aus.
    4. Wählen Sie die Formschaltfläche "Oval".
    5. Gehen Sie zu 'Image → Type → 32 Bit".
    6. Gehen Sie zu "Bearbeiten → Invertieren".
    7. Gehen Sie zu "Analysieren → Messen".
    8. Kopieren und analysieren Sie die Daten in einer Tabelle.

Ergebnisse

Abbildung 1.Fourier-Transformations-Infrarot-Spektren (FTIR) von unbehandeltem und APS-behandeltem quadratischem Filterpapier mit mittlerem Durchfluss (A) und quadratischem Fast-Flow-Filterpapier (B). A. Die Spektren für unbehandeltes quadratisches Filterpapier mit mittlerem Durchfluss waren ähnlich wie bei quadratischem Papier, das mit APS behandelt wurde. Die Zu...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zellulose-Filterpapier, Grade1 (Filterpapier mit mittlerem Durchfluss)	GE Healthcare Pte Ltd Singapur	1001 110
Zellulose-Filterpapier, Güteklasse 113 (Schnellfluss-Filterpapier)	Sigma-Aldrich, Singapur	Tel.: 1113-320
3-Aminopropyltrimethoxysilan	Sigma-Aldrich, Singapur	Nr. T1255	>96 %
Glutaraldehyd	Sigma-Aldrich, Singapur	Nr. G6257	Klasse II, 25 % in H2O
Rinderserum-Album	Sigma-Aldrich, Singapur	Nr. A2153
Magermilchpulver	Louis François		Verpackt von Kitchen Capers, Singapur
Tris-Basis	Promega	Nr. H5135
Natrium-Periodat	Merck	106597
Na2HPO4	Merck	106585
KH2PO4	Merck	104873
NaCl	CALBIOCHEM	567441
NaOH	Merck	106462
hcl	Merck	100317
Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)	N/A	N/A	PBS, das 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 8,0 mmol/L Na2HPO4 und 1,5 mmol/L KH2PO4 enthält, wird mit Wasser hergestellt und mit 0,1 mol/L NaOH oder 0,1 mol/L HCl auf pH 7,4 eingestellt
Aceton	Tee Hai Chem Pte Ltd Singapur	9005-68
Mischung aus TMB und Wasserstoffperoxidlösung	1-stufige ultra TMB-ELISA-Lösung, Thermo Scientific Pierce	Artikel-Nr.: 34029	1 L
Affinitätsgereinigter Antikörper aus der Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc-Beschichtung	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131A
Referenzserum für Mäuse	Bethyl Laboratories, Inc	RS10-101-5	9,5 mg/ml
HRP-konjugierter Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc-Nachweis-Antikörper	Bethyl Laboratories, Inc	A90-131P
Ausrüstung
Fourier-Transformations-Infrarot-Spektralphotometer	Shimadzu IR Prestige-21	N/A
Ofen	NUVE FN500	N/A
Turbomischer VM-2000	MYC LTD	N/A
Bild J	RGB, kostenloser Download	N/A