>1. Bildung von C. tropicalis Biofilmen
- Bereiten Sie Candida-Biofilme in einer 96-Well-Mikrotiterplatte aus Polystyrol mit flachem Boden vor, wie zuvor beschrieben (Abbildung 1).
- 100 μl C. tropicalis-Kultur (aus 106 Zellen/ml-Stamm, wie oben vorbereitet) mit einer Mehrkanalpipette in eine 96-Well-Mikrotiterplatte geben (Abbildung 2A). Die letzten beiden Spalten (11 und 12) sind als "kein Pilz plus Serum" und "kein Pilz und kein Serum" als Negativkontrollen zu halten, indem keine Pilzzellen hinzugefügt werden. Füllen Sie die Spalten 11 und 12 mit 100 μl 1640 Morpholinpropansulfonsäure (MOPS) des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) allein.
- Decken Sie die Mikrotiterplatte mit einem Deckel und Alufolie ab. Die Platte 24 h bei 37 °C stationär inkubieren.
- Am nächsten Tag aspirieren Sie das Medium vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in einer umgekehrten Position auf die Löschblätter, um eventuelle Medienreste zu entfernen.
- Waschen Sie die Platte mit 200 μl 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pro Well) mit einer Mehrkanalpipette. Geben Sie PBS sehr vorsichtig entlang der Seitenwände der Vertiefung, um eine Störung der Biofilme zu vermeiden. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche 2x (insgesamt drei Wäschen).
- Um überschüssiges PBS zu entfernen, trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft.
>2. Behandlung von Biofilm mit Antikörpern
HINWEIS: Biofilme können jetzt verarbeitet werden, um die Hemmung der Biofilmreifung durch Antikörper zu beurteilen. Als Quelle für polyklonale Antikörper wurde Mausserum verwendet. Verschiedene Gruppen von Sap2-immunisierten (Sap2-Albicaner, Sap2-tropicalis und Sap2-parapsilosis) sowie schein-immunisierte Mäuse wurden retroorbital geblutet und Serum isoliert. Das Vorhandensein von Anti-Sap2-Antikörpern wurde mit Hilfe eines Sap2-spezifischen Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestätigt.
- Führen Sie vor der Anwendung eine Hitzeinaktivierung des Serums (Quelle für polyklonale Antikörper) bei 56 °C für 30 Minuten durch, um die Rolle des Komplements bei der inhibitorischen Aktivität auszuschließen. Inaktivieren Sie das Serum bei Hitze, bevor Sie das Serum verdünnen.
Anmerkung: Verwenden Sie Serum von scheinimmunisierten Mäusen, präimmunen Mäusen und Sap2-spezifischem Antikörper-depletiertem Serum als zusätzliche Kontrollen. Antikörper-depletiertes Serum wurde gemäß einer früheren Studie hergestellt. Unter den seriellen Verdünnungen (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1.600, 1:3.200, 1:6.400 und 1:12.800) für Serum, die in diesem Protokoll getestet wurden, wurde eine Hemmung der Biofilmreifung bei 1:25, 1:50 und 1:100 beobachtet; Daher wurde 1:50 gewählt, um ein Gleichgewicht zwischen Hemmung und Serumverbrauch herzustellen.
- Bereiten Sie serielle Verdünnungen von hitzeinaktivierten Serumproben in sterilem RPMI 1640 MOPS-Medium (1:50) vor. Verwenden Sie eine übliche Serumverdünnung (1:50) für alle zu testenden Serumproben auf Hemmung der Biofilmreifung.
- Geben Sie 100 μl der ausgewählten Serumverdünnung in jede Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte. Fügen Sie für jede Probe Serumverdünnungen in doppelter Ausführung hinzu, wie in der beigefügten Anordnung dargestellt (Abbildung 2B).
- In Spalte 10 ist keine Serumverdünnung zuzugeben, sondern nur RPMI 1640 MOPS-Medium für die Positivkontrolle nur mit Pilzen.
Anmerkung: Spalte 10, Zeilen G1-G8 und H1-H8 wiesen zunächst Pilzzellen in RPMI-MOPS auf. Während jedoch RPMI-MOPS auch nach 24 h in Spalte 10 hinzugefügt wurde, dienten die Zeilen G1-G8 als PBS-Kontrolle und die Zeilen H1-H8 als No-Serum-Kontrolle nach 24 h.
- Geben Sie in Spalte 11 eine Verdünnung des Serums von 1:50 in alle Vertiefungen, um als Negativkontrolle ohne Pilze plus Serum zu dienen.
- In Spalte 12 ist keine Serumverdünnung in eine Vertiefung zu geben; bewahren Sie dies als Negativkontrolle ohne Pilz und Serum auf.
- Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Alufolie ab. Inkubieren Sie die Platte 24 Stunden lang bei 37 °C.
>3. Schätzung der Stoffwechselaktivität von Biofilmen
- Am nächsten Tag aspirieren Sie das Serum vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette (ohne die Biofilme zu berühren oder zu stören). Klopfen Sie die Platte vorsichtig in einer umgekehrten Position auf die Löschblätter, um Serumreste zu entfernen.
- Waschen Sie die Platte mit 200 μl 1x PBS (pro Well) mit einer Mehrkanalpipette und fügen Sie das PBS entlang der Seitenwände der Vertiefung hinzu, um eine Störung der Biofilme zu vermeiden. Aspirieren Sie das PBS vorsichtig mit einer Mehrkanalpipette und wiederholen Sie den PBS-Waschgang 2x (insgesamt drei Waschgänge). Trocknen Sie die Platte (ohne Deckel) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer biologischen Sicherheitswerkbank an der Luft, um überschüssiges PBS zu trocknen.
- Zubereitung von XTT(2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilid)/Menadion:
- Bereiten Sie XTT in sterilem Ringers-Laktat als 0,5 g/L-Lösung vor. Löse 25 mg XTT in 50 ml filtersterilisiertem Ringers-Laktat. Aliquot 10 mL in separaten Röhrchen, die mit Aluminiumfolie bedeckt sind, und bei -80 °C lagern.
- Bereiten Sie Menadion als 10 mM Brühe vor. 8,6 mg Menadion in 5 ml Aceton auflösen und 50 μl in 100 separate Mikroröhrchen verteilen. Die Aliquots bei -80 °C lagern.
- Bereiten Sie XTT/Menadion-Lösung kurz vor der Verwendung vor, indem Sie 10 ml XTT einnehmen und 1 μl Menadion hinzufügen, um eine 1 μM Arbeitslösung zu erhalten.
- Fügen Sie 100 μl der XTT/Menadion-Lösung pro Vertiefung der 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu. Decken Sie die Platte mit einem Deckel und Alufolie ab. Die Platte 2 h bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
- Übertragen Sie 80 μl des farbigen Überstands aus jeder Vertiefung in eine frische 96-Well-Platte. Lesen Sie die Platte bei 490 nm ab.
- Berechnen Sie den Mittelwert der Absorptionswerte der Vertiefungen in Spalte 10 (Positivkontrolle nur für Pilze), der als Referenzwert für die Berechnung der prozentualen Biofilmhemmung durch jede Serumprobe unter Verwendung von Gleichung (1) dient.
% Biofilm-Hemmung = 100 - 
× 100 (1)
