Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Büschelzellen in Jejunum-Kryosektionen

Abstract

Quelle: Mizutani, Y. et al., Verwendung von Anti-Phospho-Girdin Antikörpern zur Visualisierung von Darmbüschelzellen in frei schwebenden Jejunum-Kryosektionen der Maus.J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Darmbüschelzellen in frei schwebenden Jejunum-Kryosektionen von Mäusen. Innerhalb der Darmzotten deutet die Kolokalisation von grüner Fluoreszenz an der luminalen Spitze mit einer ausgedehnten roten Wurzelmasse auf das Vorhandensein von Büschelzellen hin.

Protocol

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitungen

1. 10 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 32,27 g Natriumhydrogenphosphat (Na₂HPO 4,12H₂O), 4,5 g Natriumdihydrogenphosphat (NaH₂PO _{4,2H 2}O), 80,0 g Natriumchlorid (NaCl) zu Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 10 l geben. Lösung bei Raumtemperatur (RT) lagern.
2. 200 mL PBS-T: 200 mL PBS aus Schritt 1.1 mit 100 μl Polyoxyethylen (10)-octylphenylether auf eine Endkonzentration von 0,05 % (vol: vol) herstellen. Bei RT lagern.
3. Bereiten Sie mit Handschuhen und Augenschutz 50 ml 15%ige Saccharose in 10%iger gepufferter neutraler Formalinlösung vor: 7,5 g Saccharose zugesetzt zu 10%iger gepufferter neutraler Formalinlösung (Materialtabelle) bis zu einem Endvolumen von 50 ml. Lagern unter RT.
   Vorsicht: Das Einatmen und/oder der Haut-/Augenkontakt mit Formaldehyd in 10 % gepufferter neutraler Formalinlösung kann gefährlich sein. Gehen Sie mit Vorsicht vor.
4. Bereiten Sie 1,5 ml mit 200 Einheiten/ml Phalloidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat-Stammlösung vor: Phalloidin-Fluoreszenz-Farbstoff-Konjugat (300 Einheiten in 1 Fläschchen, lyophilisierte Feststoffe, Anregungs- und Emissionswellenlängen: 581 nm bzw. 609 nm), suspendiert in 1,5 ml Methanol. Lagern Sie die Lösung im Dunkeln bei -20 °C.
5. Bereiten Sie 5 mg/ml 4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid (DAPI) -Stammlösung vor: 10 mg DAPI in 2 ml N,N-Dimethylformamid (DMF). Lagern Sie die Lösung im Dunkeln bei -20 °C.
6. Bereiten Sie 5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS vor: 0,5 g BSA, 10 ml PBS. Bei 4 °C lagern.
7. Entfernen Sie die abgeschrägte Spitze einer 18-Gauge-Nadel mit einer Zange und drücken Sie das abgeschrägte Ende mit einer Zange in Längsrichtung zusammen, damit die Flüssigkeit durch das Nadellumen fließen kann (Abbildung 1A1).
   Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>2. Tierdissektion und Isolierung von Jejunum

1. Perfusionsfixierung einer Maus
   1. Tragen Sie Handschuhe und arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich.
   2. Bereiten Sie ein 100-ml-Glasbecherglas, 10 % gepufferte neutrale Formalinlösung, chirurgische Instrumente (Schere, Pinzette), eine Metallschiene, 6-0-Nylon-Schnittnähte, eine 18-Gauge-Gerade Nadel, die wie in 1.7 vorbereitet wurde, eine 22-Gauge-Flügelnadel, eine 20-ml-Spritze vor.
   3. Laden Sie 20 ml 10%ige gepufferte neutrale Formalinlösung aus dem Glasbecherglas in die 20-ml-Spritze und befestigen Sie die 22-Gauge-Flügelnadel am Auslass.
   4. Bereiten Sie flüssige Gelatine vor, indem Sie 1 g Gelatinepulver zu 20 ml PBS (endgültige 5 % Gelatine) in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Nach 15 min Einweichen bei RT 15 min bei 50 °C im Wasserbad ohne Schütteln inkubieren.
   5. Kurz vortexen und weitere 15 min bei 50 °C inkubieren, um die Gelatine vollständig aufzulösen. Lassen Sie die Tube bis zum Gebrauch bei RT.
   6. Euthanasiere eine erwachsene Maus durch Gebärmutterhalsluxation.
   7. Legen Sie die Maus aus Schritt 2.1.6 auf eine metallische Schiene und machen Sie mit chirurgischen Instrumenten einen kleinen Schnitt durch den ensiformen Knorpel in die Haut.
   8. Erweitern Sie den Schnitt mit beiden Händen, um die Brust- und Bauchregion freizulegen.
   9. Öffnen Sie das Bauchfell, um das Zwerchfell freizulegen, und öffnen Sie dann das Zwerchfell auf beiden Seiten.
   10. Schneiden Sie den Thoraxkäfig entlang der vorderen Achsellinien auf beiden Seiten und entfernen Sie dann die Brustwand, indem Sie in Querrichtung an der Position des Thymus schneiden, um das Herz freizulegen.
   11. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Ohrmuschel des rechten Vorhofs, um das Blut abzulassen, und führen Sie eine 22-Gauge-Flügelnadel in die Spitze des linken Ventrikels ein. Drücken Sie den Kolben, um das Gewebe mit einer 10%igen gepufferten neutralen Formalinlösung zu durchbluten.
   12. Nachdem Sie Organe im Becken freigelegt haben, schneiden Sie das Ende des Rektums vom Anus ab und trennen Sie den Darm vom Körper, indem Sie das Mesenterium durchtrennen.
   13. Um das Jejunum zu isolieren, schneiden Sie den Darm in einem Abstand von 4 cm von der Analseite des Magenantrums ab. Entsorgen Sie die anale Hälfte des restlichen Dünndarms.
   14. Schneiden Sie das Jejunum in zwei Hälften, um den Spülvorgang zu erleichtern. Laden Sie 20 ml 10%ige gepufferte neutrale Formalinlösung in die 20-ml-Spritze und befestigen Sie die in Schritt 1.7 hergestellte 18-Gauge-Gerade Nadel am Auslass.
   15. Injizieren Sie 10% gepufferte neutrale Formalinlösung von einem Ende des abgeschnittenen Jejunums, um den Darminhalt auszuspülen und die Oberfläche des Darmlumens zu fixieren (Abbildung 1A2).
   16. Waschen Sie das Darmlumen, indem Sie PBS injizieren, wie in Schritt 2.1.15 beschrieben.
   17. Spülen Sie flüssige Gelatine in das Darmlumen, wie in Schritt 2.1.15 beschrieben, um PBS durch flüssige Gelatine zu ersetzen.
   18. Verschließen Sie ein Ende des abgeschnittenen Jejunums durch Nahtligatur mit einer 6-0-Nylon-Schnittnaht, füllen Sie das Jejunum mit flüssiger Gelatine und verschließen Sie das gegenüberliegende Ende durch Nahtligatur (Abbildung 1A3).
   19. Fügen Sie vier Nahtknoten hinzu, um einen wurstförmigen Jejunumabschnitt an den eingedrückten Teil eines Kryomolds anzupassen (Abbildung 1A4).
       Anmerkung: Für Kryoformen mit einem eingedrückten Querschnitt von 20 mm x 25 mm x 5 mm ist ein ~20 mm wurstartiger Jejunumabschnitt vorzuziehen.
   20. Das Gewebe wird über Nacht bei 4 °C in 50 ml 15 % Saccharose in 10 % gepufferter neutraler Formalinlösung eingeweicht.
       Anmerkung: Diese Schritte gewährleisten die Kryoprotektion durch Saccharose und die Proteinfixierung durch Formalin von Gelatine und Gewebe. Formalin-gelatinierte Gelatine schmilzt bei RT nicht, während nicht fixierte gelatinierte Gelatine bei 4 °C bei RT schmilzt.

>3. Schnappgefrieren von mit Gelatine gefüllten Jejunumgeweben

1. Durch das Durchtrennen des Jejunums an den Nahtknoten erhält man drei wurstartige Jejunumstücke, die an beiden Enden ligiert sind (Abbildung 1A4). Richten Sie die wurstartigen Stücke in einer Kryoform aus, um die Einbettmasse für die Präparation von gefrorenen Gewebeproben hinzuzufügen.
2. Frieren Sie den Kryoschimmel in Isopentan ein, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird. Kryoformen bei -80 °C lagern
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden.

>4. Immunfluoreszenz von Büschelzellen mittels freischwebender Kryosektionen

1. Kryosektion
   1. Stellen Sie sowohl die Temperatur der Kryostatkammer (CT) als auch die Objekttemperatur (OT) auf -22 °C ein. Legen Sie den gefrorenen Gewebeblock für mindestens 15 Minuten in einen Kryomold in der Kryostatkammer.
   2. Geben Sie 3 ml PBS in eine 35-mm-Kulturschale.
   3. Entfernen Sie den gefrorenen Gewebeblock aus dem Kryomold und schneiden Sie den Block mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, um den Querschnitt des Jejunums freizulegen. Montieren Sie eine Hälfte des Blocks auf ein Spannfutter (einen Kryostat-Adapter), um die Schnittebene mit der Rasierklinge zu durchtrennen.
   4. Das mit Gelatine gefüllte Jejunum in 30 μm dicke Abschnitte schneiden. Mit einer gefrorenen Pinzette werden die Schnitte vorsichtig in die in Schritt 4.1.2 vorbereitete 35-mm-Kulturschale überführt (Abbildung 2B, rechts).
2. Anwendung von Primärantikörpern
   1. Die frei schwebenden Abschnitte in der 35-mm-Kulturschale werden 3 Mal für je 5 min mit 3 mL PBS-T unter leichtem Schütteln auf einem reziproken Shaker (ca. 36 Mal/min) gewaschen.
   2. Antigen-Rückhollösung vorbereiten: 0,3 ml Konzentrat der Antigen-Rückhollösung (Materialtabelle) in 2,7 ml Reinstwasser. Geben Sie 3 ml Antigen-Retrievallösung in die 35-mm-Kulturschale mit frei schwebenden Abschnitten.
   3. Schließen Sie den Deckel, verschließen Sie den Spalt zwischen der Schale und dem Deckel mit einem Streifen Vinylband und inkubieren Sie bei 50 °C in einem Hybridisierungsinkubator für 3 h ohne Schütteln.
   4. Die Schale aus dem Inkubator nehmen und 20 Min. bei RT abkühlen lassen. Nach dem Entfernen des Vinylbandes waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für 5 min mit jeweils 3 mL PBS-T und leichtem Schütteln.
   5. Aspirieren Sie das PBS-T und geben Sie 5 Tropfen Blocklösung (Materialtabelle) auf die Abschnitte. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT mit leichtem Schütteln.
   6. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor: 495 μl 5 % BSA in PBS mit 5 μl Phospho-Y1798 Girdin (pY1798)-Antikörpern (Materialtabelle). Geben Sie 500 μl Primärantikörperlösung auf die Schnitte (die Blockierungslösung muss nicht entfernt werden).
   7. Stellen Sie die Schale in eine befeuchtete Inkubationskammer und inkubieren Sie sie über Nacht bei 4 °C unter leichtem Schütteln.
      Anmerkung: Die Inkubation über Nacht kann auf bis zu drei Nächte verlängert werden.
3. Anwendung von Sekundärantikörpern
   1. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 Minuten in 3 mL PBS-T unter leichtem Schütteln.
   2. Bereiten Sie verdünnte DAPI-Stammlösung vor: 2 μl DAPI-Stammlösung (Schritt 1.5), 998 μl PBS.
   3. Herstellung einer Sekundärantikörperlösung: 476 μl 5 % BSA in PBS, 10,5 μl verdünnte DAPI-Lösung, 12,5 μl Phalloidin-Fluoreszenzfarbstoff-Konjugat-Stammlösung, 1 μl Anti-Kaninchen-IgG-Fluoreszenz-Farbstoffkonjugat (Wellenlänge: Anregung 496 nm, Emission 520 nm).
   4. Nach der Aspiration des PBS-T die Sekundärantikörperlösung auftragen und in einer lichtgeschützten Inkubationskammer bei RT 30 Minuten lang unter leichtem Schütteln inkubieren.
   5. Waschen Sie die Abschnitte 3 Mal für jeweils 5 Minuten mit 3 mL PBS-T und leichtem Schütteln.
   6. Entfernen Sie nach der letzten Wäsche das PBS-T und ersetzen Sie es durch 3 ml PBS ohne Polyoxyethylen(10)-octylphenylether. Übertragen Sie die Schüssel in ein stereoskopisches Mikroskop.
   7. Geben Sie 200 μl PBS in einem Tropfen auf die Mitte eines MAS-beschichteten Weißglasobjektträgers und übertragen Sie einen Jejunumabschnitt aus der Schale mit einer P200-Pipettenspitze in das Tröpfchen.
   8. Nachdem Sie die Schnittausrichtung unter dem stereoskopischen Mikroskop angepasst haben, aspirieren Sie alle verbleibenden PBS, die den Schnitt umgeben.
   9. Fügen Sie 20 μl wässriges Eindeckmedium hinzu und legen Sie ein Deckglas von 20 x 20 mm auf das Medium.
   10. Versiegeln Sie die Deckglaskanten sofort mit Eindeckmedien auf Xylolbasis. Legen Sie das Objektträger auf eine Holzmappe und lassen Sie das Einbettmedium auf Xylolbasis bei RT 2 - 3 h erstarren.
       Anmerkung: Das Protokoll kann hier pausiert werden. Nach dem Erstarren des Xylol-basierten Einbettmediums können die Objektträger für 2 - 3 Wochen in einer lichtgeschützten Objektträgerbox bei RT gelagert werden.

>5. Konfokale Mikroskopie

1. Tragen Sie Immersionsöl auf das 63X-Objektiv eines konfokalen Mikroskops auf. Drehen Sie das Deckglas nach unten und legen Sie es auf die Bühne.
2. Digitalisieren Sie die TC-Bilder, die bei den Laserwellenlängen 405, 488 und 555 nm aufgenommen wurden, und speichern Sie die Bilder im TIFF-Format (.tiff).
   Anmerkung: Wählen Sie ein Detektionsfilter-Set, das für die Fluoreszenzfarbstoffe geeignet ist (d. h. Anregungs-/Emissionsmaxima: 358/461 nm, 490/525 und 590/617).

Results

Abbildung 1: Gelatinefüllung von Jejunumschnitten zur morphologischen Konservierung von Kryoschnitten
(A) Fotografien von Verfahren zur intraluminalen Füllung von Mausjejunum mit Gelatine. (A1) Die abgeschrägte Spitze einer 18-Gauge-Geradenadel wurde entfernt, um ein Durchstechen der Darmwand zu vermeiden. (A2) Gepufferte neutrale Formalinlös...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Slc:DDY 6 Wochen alte weibliche Mäuse	Chubu Kagaku Shizai	nicht zutreffend
Dinatriumhydrogenphosphat 12-Wasser (Na2HPO412H2O)	Wako	Tel.: 196-02835
Natriumdihydroenphosphat-Dihydrat (NaH2PO42H2O	Wako	Tel.: 199-02825
Natriumchlorid (NaCl)	Wako	Tel.: 199-10665
Triton X-100, Polyoxyethylen(10)-octylphenylether	Katayama Chemie	nicht zutreffend
Saccharose	Wako	Tel.: 190-00013
10% gepufferte neutrale Formalinlösung	Muto Chemikalie	20215	Schritt 1.3.
Phalloidin-Fluoreszenz-Farbstoff-Konjugat, Alexa Fluor 594 Phalloidin	ThermoFisher Scientific	Nr. A12381
Methanol	Nacalai Tesque	Artikel-Nr.: 21915-35
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)	ThermoFisher Scientific	Nr. D1306
N.N-Dimethylformamid (DMF)	Nacalai Tesque	Nr. 13015-75
Rinderserumalbumin	Sigma	Nr. A9647-10G
18-Gauge-Nadel aus Edelstahl	Terumo	NN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm Naht mit Nylonschnitt, Crownjun	Kono Seisakusho	nicht zutreffend
22-Gauge-Flügelnadel	Terumo	SV-22DLK
20 mL TERUMO Spritze	Terumo	SS-20ES
50 mL Zentrifugenröhrchen	Wärmekraftwerk	Artikel-Nr.: 91050
15 mL Iwaki-Zentrifugenröhrchen	Iwaki	Artikel-Nr.: 2325-015
1,5 mL Mikro-Reagenzglas	Stern	RSV-MTT1.5
Gelatinepulver, Gelare-blanc	Nitta Biolab	Nr. 2809
Einbettmasse für gefrorene Gewebeproben, O.C.T. Compound 118 mL 12 Stück	Sakura FineTech	Artikel-Nr.: 4583
Cryomold, KRYOSCHALE Nr. 3, 125 Stück, Vertiefung 20 x 25 x 5 (mm)	Die Arbeit von Shoei	Nr. 1101-3
Isopentan	Nacalai Tesque	Tel.: 26404-75
Falcon Zellkulturschale 35 x 10mm Easy-Grip	Corning	353001
Konzentrat der Antigen-Rückhollösung, Ziel-Rückhollösung pH 9 10x	Dako	Nr. S2367	Konzentrat der Antigen-Rückhollösung in Schritt 4.2.2.
Protein-Block	Dako	X0909	Blockierende Lösung in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) Antikörper und Virtuosen	Immunbiologische Laboratorien (IBL) = Unternehmen X	Artikel-Nr.: 28143	Phospho-Y1798 Girdin-Antikörper in Schritt 4.2.6.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	Nr. A11034
Aquous Eindeckmittel, Prolong Gold Antifade Eindeckmittel	ThermoFisher Scientific	Nr. P36930
Deckgläser, Matsunami Micro Deckglas 22 x 22 mm 100 Stück Dicke Nr.1	Matsunami Glas	C022221
Entellan Neues, xylolbasiertes Einbettmedium für die Mikroskopie	Merck Millipore	107961
MAS-beschichtetes Objektträgerglas weiß	Matsunami Glas	MI-MAS-01
Holzmappe KO-Typ	Die Arbeit von Shoei	Tel.: 99-40007
Immersionsöl 518 F fluoreszenzfrei 20 ml	Zeiss	Artikel-Nr.: 444960
Pipetten, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)	Gilson	F144801, F123600, F123601, F123602
System zur Herstellung von Reinstwasser	Advantec	GS-590
Kunststoffhandschuh, Star Nitril Handschuh	Stern	RSU-NGVM
Kälteregler	Leica Mikrosysteme	CM1950
Tiefkühltruhe, SANYO Ultra Low	Sanyo	MDF-382
Vitrinen-Kühlschrank	Nihon Gefrierschrank	NC-ME50EC
Wasserbad, Thermominder SDminiN (zum Auflösen von Gelatine bei 50 °C)	Taitec	Artikel-Nr.: 0068750-000
Hybridisierungs-Inkubator (für die Antigen-Entnahme bei 50 °C)	Taitec	HB-100
Inkubationskammer für die Immunfärbung	Cosmo Bio	10TUN
Reziproker Schüttler für die Immunhistochemie (für Raumtemperatur)	Taitec	NR-1
Reziproker Schüttler für die Immunhistochemie (für 4 C)	Tokio Rika Kikai	MMS-3010
Stereoskopisches Mikroskop (für die Handhabung von Gewebe)	Olymp	SZ61
Stereoskopisches Mikroskop (für Abbildung 1B)	Leica Mikrosysteme	M165FC
Fluoreszenzmikroskop (für Abbildung 3)	Nikon	E800
Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop	Zeiss	LSM700