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Eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Büschelzellen in Jejunum-Kryosektionen

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

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Quelle: Mizutani, Y. et al., Verwendung von Anti-Phospho-Girdin Antikörpern zur Visualisierung von Darmbüschelzellen in frei schwebenden Jejunum-Kryosektionen der Maus.J. Vis. Exp. (2018)

Dieses Video zeigt eine Immunfluoreszenz-basierte Methode zur Visualisierung von Darmbüschelzellen in frei schwebenden Jejunum-Kryosektionen von Mäusen. Innerhalb der Darmzotten deutet die Kolokalisation von grüner Fluoreszenz an der luminalen Spitze mit einer ausgedehnten roten Wurzelmasse auf das Vorhandensein von Büschelzellen hin.

Protocol

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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitungen

  1. 10 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS): 32,27 g Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO 4,12H2O), 4,5 g Natriumdihydrogenphosphat (NaH2PO 4,2H 2O), 80,0 g Natriumchlorid (NaCl) zu Reinstwasser bis zu einem Endvolumen von 10 l geben. Lösung bei Raumtemperatur (RT) lagern.
  2. 200 mL PBS-T: 200 mL PBS aus Schritt 1.1 mit 100 μl Polyoxyethylen (10)-octylphenylether auf ein....

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Results

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Abbildung 1: Gelatinefüllung von Jejunumschnitten zur morphologischen Konservierung von Kryoschnitten
(A) Fotografien von Verfahren zur intraluminalen Füllung von Mausjejunum mit Gelatine. (A1) Die abgeschrägte Spitze einer 18-Gauge-Geradenadel wurde entfernt, um ein Durchstechen der Darmwand zu vermeiden. (A2) Gepufferte neutrale Formalinlös.......

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Disclosures

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Es wurden keine Interessenkonflikte angegeben.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Slc:DDY 6 Wochen alte weibliche MäuseChubu Kagaku Shizainicht zutreffend
Dinatriumhydrogenphosphat 12-Wasser (Na2HPO412H2O)WakoTel.: 196-02835
Natriumdihydroenphosphat-Dihydrat (NaH2PO42H2OWakoTel.: 199-02825
Natriumchlorid (NaCl)WakoTel.: 199-10665
Triton X-100, Polyoxyethylen(10)-octylphenyletherKatayama Chemienicht zutreffend
SaccharoseWakoTel.: 190-00013
10% gepufferte neutrale FormalinlösungMuto Chemikalie20215Schritt 1.3.
Phalloidin-Fluoreszenz-Farbstoff-Konjugat, Alexa Fluor 594 PhalloidinThermoFisher ScientificNr. A12381
MethanolNacalai TesqueArtikel-Nr.: 21915-35
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid)ThermoFisher ScientificNr. D1306
N.N-Dimethylformamid (DMF)Nacalai TesqueNr. 13015-75
RinderserumalbuminSigmaNr. A9647-10G
18-Gauge-Nadel aus EdelstahlTerumoNN-1838R
U.S.P. 6-0, 60 cm Naht mit Nylonschnitt, CrownjunKono Seisakushonicht zutreffend
22-Gauge-FlügelnadelTerumoSV-22DLK
20 mL TERUMO SpritzeTerumoSS-20ES
50 mL ZentrifugenröhrchenWärmekraftwerkArtikel-Nr.: 91050
15 mL Iwaki-ZentrifugenröhrchenIwakiArtikel-Nr.: 2325-015
1,5 mL Mikro-ReagenzglasSternRSV-MTT1.5
Gelatinepulver, Gelare-blancNitta BiolabNr. 2809
Einbettmasse für gefrorene Gewebeproben, O.C.T. Compound 118 mL 12 StückSakura FineTechArtikel-Nr.: 4583
Cryomold, KRYOSCHALE Nr. 3, 125 Stück, Vertiefung 20 x 25 x 5 (mm)Die Arbeit von ShoeiNr. 1101-3
IsopentanNacalai TesqueTel.: 26404-75
Falcon Zellkulturschale 35 x 10mm Easy-GripCorning353001
Konzentrat der Antigen-Rückhollösung, Ziel-Rückhollösung pH 9 10xDakoNr. S2367Konzentrat der Antigen-Rückhollösung in Schritt 4.2.2.
Protein-BlockDakoX0909Blockierende Lösung in 4.2.5.
Phospho-Y1798 girdin (pY1798) Antikörper und VirtuosenImmunbiologische Laboratorien (IBL) = Unternehmen XArtikel-Nr.: 28143Phospho-Y1798 Girdin-Antikörper in Schritt 4.2.6.
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificNr. A11034
Aquous Eindeckmittel, Prolong Gold Antifade EindeckmittelThermoFisher ScientificNr. P36930
Deckgläser, Matsunami Micro Deckglas 22 x 22 mm 100 Stück Dicke Nr.1Matsunami GlasC022221
Entellan Neues, xylolbasiertes Einbettmedium für die MikroskopieMerck Millipore107961
MAS-beschichtetes Objektträgerglas weißMatsunami GlasMI-MAS-01
Holzmappe KO-TypDie Arbeit von ShoeiTel.: 99-40007
Immersionsöl 518 F fluoreszenzfrei 20 mlZeissArtikel-Nr.: 444960
Pipetten, Pipetman P (P2, P20, P200, P1000)GilsonF144801, F123600, F123601, F123602
System zur Herstellung von ReinstwasserAdvantecGS-590
Kunststoffhandschuh, Star Nitril HandschuhSternRSU-NGVM
KältereglerLeica MikrosystemeCM1950
Tiefkühltruhe, SANYO Ultra LowSanyoMDF-382
Vitrinen-KühlschrankNihon GefrierschrankNC-ME50EC
Wasserbad, Thermominder SDminiN (zum Auflösen von Gelatine bei 50 °C)TaitecArtikel-Nr.: 0068750-000
Hybridisierungs-Inkubator (für die Antigen-Entnahme bei 50 °C)TaitecHB-100
Inkubationskammer für die ImmunfärbungCosmo Bio10TUN
Reziproker Schüttler für die Immunhistochemie (für Raumtemperatur)TaitecNR-1
Reziproker Schüttler für die Immunhistochemie (für 4 C)Tokio Rika KikaiMMS-3010
Stereoskopisches Mikroskop (für die Handhabung von Gewebe)OlympSZ61
Stereoskopisches Mikroskop (für Abbildung 1B)Leica MikrosystemeM165FC
Fluoreszenzmikroskop (für Abbildung 3)NikonE800
Konfokales Laser-Scanning-MikroskopZeissLSM700

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