Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Transfektion von 293T-Zellen mit Luciferase und Ernte des Virusüberstands
- Kultur von 293T-Zellen
- Bereiten Sie das Medium vor, indem Sie jeweils einem Liter Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) Folgendes hinzufügen: 110 ml hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), 11 ml Penicillin-Streptomycin.
- 5 x 106 293T-Zellen werden aufgetaut und mit dem wie oben beschrieben vorbereiteten Medium in einen T175-Kolben überführt.
- Teilen Sie die 293T-Zellen 6 Tage lang alle 3 Tage im Verhältnis 1:10. Lassen Sie die Zellen nicht zu mehr als 90 % zusammenfließen.
- Transfektion von 293T-Zellen
Anmerkung: Die folgenden Reagenzienmengen werden für die Transfizierung eines T175-Kolbens mit 293T-Zellen berechnet. Passen Sie entsprechend an, wenn mehr Kolben umgeschlagen werden sollen.
- Übertragen Sie 1,5 ml Medium mit einer Pipette auf jedes der beiden 50-ml-Röhrchen. In ein Röhrchen werden 10 μg VSV-G-Plasmid, 20 μg Gag/pol und 20 μg Click-Beetle-Rot-TD-Tomaten-Luziferase-Plasmid (CBR-TDR) gegeben und gemischt. In das andere Röhrchen werden 100 μl DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz gegeben und gemischt. Inkubieren Sie beide Röhrchen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min.
Anmerkung: Alle in diesem Manuskript beschriebenen Plasmide wurden von Dr. Vladimir Ponomarev zur Verfügung gestellt.
- Das Medium, das das DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz enthält, wird tropfenweise in das Röhrchen mit den DNA-Plasmiden gegeben (über einen Zeitraum von ca. 30 s) und vorsichtig mit einer Pipette gemischt. 20 Minuten bei RT inkubieren.
- Während dieser 20-minütigen Inkubation lösen Sie die 293T-Zellen ab, indem Sie 5-10 ml 0,05% Trypsin hinzufügen. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie 10 mL Medium hinzu und zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 ml Medium.
- Das Medium, das das DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz und die DNA-Plasmide enthält, wird zu den 293T-Zellen gegeben und 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.
- In einen T175-Kolben umfüllen und 18 ml Medium hinzufügen. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.
- Aspirieren Sie das Medium am nächsten Tag vorsichtig mit einer Glaspipette, ohne die Zellen abzulösen. Durch 18 ml frisches Medium ersetzen. Inkubieren Sie bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator.
- Gewinnung von Virusüberständen
- Entfernen Sie den Virusüberstand mit einer Pipette, die auf Eis gelegt wird. Zentrifugieren Sie bei 800 x g für 5 min, um die Zellen und Ablagerungen zu pelletieren.
Anmerkung: Wenn das Zellpellet groß ist, wurden die Zellen wahrscheinlich aus dem Kolben aufgebrochen, als der Überstand entfernt wurde. Diese Zellen können in einem neuen Kolben mit frischem Medium wieder plattiert werden.
- Filtrieren Sie den Virusüberstand mit einem 0,22 μm Filter.
- Verwenden Sie den Virusüberstand sofort. Bewahren Sie es bis zu 24 Stunden auf Eis oder bei 4 °C auf oder frieren Sie es für eine Langzeitlagerung bei -80 °C ein.
>2. Expansion und Transduktion von aktivierten menschlichen T-Zellen mit Luciferase
- Aktivierung humaner T-Zellen in vitro
- Waschen Sie die Kügelchen, indem Sie 10 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in ein steriles 15-ml-Röhrchen geben, Kügelchen hinzufügen (eine Perle pro zwei T-Zellen), 2 Minuten lang in ein Magnetgestell legen und das PBS absaugen.
- Bereiten Sie das Medium wie in Schritt 1.1.1 beschrieben vor, fügen Sie dann IL-2 bis zu einer Endkonzentration von 30 IE/ml hinzu und fügen Sie die gewaschenen Kügelchen hinzu. Stellen Sie 2,5 ml Medium für jeweils zwei Millionen zu aktivierende T-Zellen her.
- Zählen Sie die T-Zellen (frisch gereinigt oder zuvor gereinigt, eingefroren, aufgetaut und gewaschen) mit einem Hämozytometer und einer Trypanblau-Färbung. Geben Sie T-Zellen zu dem in Schritt 2.1.2 vorbereiteten Medium und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Die T-Zellen expandieren mindestens 20x, abhängig von der Quelle und dem allgemeinen Gesundheitszustand der Zellen. Bestimmen Sie die Anzahl der zu aktivierenden T-Zellen, indem Sie die Anzahl berechnen, die zur Behandlung der Mäuse erforderlich ist, und durch 20 teilen. Hier wurden auf Basis von Vorversuchen 20 x 106 T-Zellen pro Maus verwendet.
- Platte 2,5 ml eines Mediums, das zwei Millionen T-Zellen, Kügelchen und (Interleukin 2) IL-2 in jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte enthält. Kultur bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator.
- Untersuchen Sie die T-Zellen in den nächsten 3 Tagen täglich unter einem 20-fachen Mikroskop, um zu bestimmen, wann mit Luciferase transduziert werden soll. Die Zellen sind bereit, wenn sie verklumpen und das Medium erschöpfen, wodurch es von rot/rosa zu hellorange wird.
- Vorbereitung von Retronektinplatten
Anmerkung: Retronektin wird verwendet, um die bei der Transduktion verwendeten Platten zu beschichten, da es die Gentransduktion verbessert.
- Geben Sie 2 ml 20 μg/ml Retronektin in PBS in eine Vertiefung einer unbehandelten 6-Well-Platte. 2 h bei RT oder 1 h bei 37 °C inkubieren. Für jeweils zwei Millionen zu transduzierende T-Zellen ist eine retronektinbeschichtete Vertiefung erforderlich.
- Aspirieren Sie das Retronektin, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen.
- Geben Sie 3 ml 2 % BSA in PBS (steril gefiltert) pro Vertiefung in die 6-Well-Platte. 30 Minuten bei RT inkubieren.
- Spinokulation
- Saugen Sie das BSA an, ohne die Unterseite der Platte zu zerkratzen.
- Waschen Sie die Vertiefungen einmal mit 3 mL PBS pro Vertiefung. Fahren Sie fort oder ersetzen Sie sie durch frisches PBS und lassen Sie die Platte über Nacht bei 4 °C abgedeckt.
- Geben Sie 2 ml CBR-TDR-Luciferase-Virusüberstand (entnommen in Schritt 1.3) pro Vertiefung.
- Zentrifugieren Sie bei 1.240 x g für 90 min bei 32 °C.
- Transduktion
- Zählen Sie die T-Zellen.
- Aspirieren Sie den Virusüberstand, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen.
- Platte zwei Millionen T-Zellen pro Well in 6 ml DMEM mit 30 I.E./ml humanem IL-2.
- Untersuchen Sie die T-Zellen täglich. Die T-Zellen sind bereit für die Expansion, wenn sie fast konfluent sind, normalerweise nach 2 Tagen.
- Wenn die Zellen fast zusammenfließen, waschen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette vom Boden der Platte ab und geben Sie jede Vertiefung in einen separaten T75-Kolben. Fügen Sie 9 ml Medium hinzu, so dass insgesamt 15 mL Medium pro Kolben vorhanden sind.
- Fügen Sie am nächsten Tag weitere 15 ml Medium hinzu. Die Zellen sollten am Tag nach dieser Zugabe von Medien bereit sein, in Mäuse injiziert zu werden. Bestätigen Sie die erfolgreiche Transduktion durch Durchflusszytometrie (das Luciferase-Konstrukt enthält ein TD-Tomatenfluorophor, das im PE-Kanal sichtbar ist).
>3. Transplantation von Luciferase-transduzierten T-Zellen in immungeschwächten Mäusen
- Bereiten Sie die T-Zellen für die Injektion vor und zählen Sie sie.
- Die T-Zellen aus den Kolben nehmen und zählen. Die Zellen sind bereit zur Injektion, wenn sie sich um das 20- bis 30-fache vergrößert haben, in der Regel am 7. Tag nach der Aktivierung.
- Die T-Zellen werden bei 800 x g 5 min lang zentrifugiert. In 2 mL Medium resuspendiert und die Kügelchen mit einem Magnetgestell entfernt.
- Bei Experimenten, bei denen T-Zellen getrennt von bispezifischen Antikörpern injiziert werden, zählen Sie die T-Zellen und resuspendieren Sie sie, so dass die Endkonzentration 20 Millionen T-Zellen pro 100 μl Medium beträgt. Fahren Sie mit Schritt 3.2 fort. Für Experimente mit ex vivo bewaffneten T-Zellen (EATs) fahren Sie mit Schritt 3.1.4 fort.
- Für Experimente mit ex vivo bewaffneten T-Zellen werden die T-Zellen gezählt und in einzelne 1,5-ml-Röhrchen für jede Gruppe aufgeteilt, mit 20 Millionen Zellen pro Maus. Wenn es zum Beispiel drei Gruppen mit jeweils fünf Mäusen gibt, bereiten Sie drei 1,5-ml-Röhrchen mit jeweils 100 Millionen T-Zellen vor.
- Zentrifugieren Sie die 1,5 mL Röhrchen bei 800 x g für 5 min. Entfernen Sie das Medium vorsichtig, ohne das T-Zell-Pellet zu stören. Resuspendieren Sie in nicht mehr als 50 μl Medien, die die bispezifischen Antikörper enthalten. Inkubieren bei RT für 30 min.
Anmerkung: Für die Zwecke der in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden proprietäre IgG-[L]-scFv T-Zell-aktivierende bispezifische Antikörper verwendet, die im Labor erzeugt wurden. Für die T-Zell-Bewaffnung verwenden Sie 5 μg Antikörper pro 20 x 106 T-Zellen. Auch kommerziell erhältliche bispezifische Antikörper könnten verwendet werden.
- Waschen Sie überschüssige Antikörper ab, indem Sie jedem Röhrchen 1.450 μl Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie 5 Minuten lang bei 800 x g, saugen Sie das Medium vorsichtig an und resuspendieren Sie es bei einer Konzentration von 20 Millionen bewaffneten T-Zellen pro 100 μl Medium.
- Injektion und Transplantation in Mäuse
- Betäuben Sie die Mäuse in einer Kammer, die 3,5 % (v/v) inhaliertes Isofluran in 1 l/min Sauerstoff liefert. Die Mäuse werden vollständig betäubt, wenn der Rückzugsreflex des Pedals der Hintergliedmaßen verschwunden ist.
HINWEIS: Bieten Sie während des gesamten Eingriffs thermische Unterstützung.
- Mit einer 26-G-Nadel werden pro Maus 20 Millionen T-Zellen retroorbital in 100 μl Medium injiziert.
- 1.000 U rekombinantes IL-2 subkutan verabreichen, um das Überleben der T-Zellen in vivo zu unterstützen.
- Verabreichen Sie die bispezifischen Antikörper retroorbital (in das Auge, das nicht für die T-Zell-Injektion verwendet wird) oder intraperitoneal. Lassen Sie die Mäuse sich von der Narkose erholen und in ihre Käfige zurückkehren.
HINWEIS: Auch hier wurden proprietäre Antikörper verwendet, die im Labor erzeugt wurden, aber es konnten stattdessen kommerziell erhältliche Antikörper verwendet werden. In den Experimenten hier wurden 0,3-10 μg Antikörper pro Maus und Dosis verabreicht. Die Antikörper wurden 3-4 Wochen lang zweimal pro Woche verabreicht.
>4. In-vivo-Bildgebung von Mäusen, die mit Luciferase-transduzierten T-Zellen transplantiert wurden
HINWEIS: Dieser Schritt muss am Tag der Bildgebung durchgeführt werden, der nicht unbedingt derselbe Tag ist, an dem die T-Zellen und/oder Antikörper den Mäusen verabreicht werden. In der Regel führen wir die Bildgebung 24 Stunden nach der Verabreichung der Luciferase-transduzierten T-Zellen durch.
- Zubereitung von D-Luciferin
- Lösen Sie 1 g D-Luciferin in 33,3 ml sterilem PBS (Endkonzentration: 30 mg/ml).
- Aliquotieren Sie das gelöste D-Luciferin in 33 x 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Röhrchen bei -20 °C.
- Am Tag der Bildgebung sind genügend Aliquots von 30 mg/ml D-Luciferin für die Anzahl der abzubildenden Tiere aufzutauen. Ein Schlauch reicht für 10 Tiere.
HINWEIS: Frieren Sie das restliche D-Luciferin nach Gebrauch wieder ein. D-Luciferin ist für mindestens fünf Gefrier-/Auftauzyklen stabil.
- Verabreichung von D-Luciferin an Mäuse
Anmerkung: Bevor Sie den Mäusen D-Luciferin verabreichen, öffnen Sie die Bildgebungssoftware und initialisieren Sie das System. Das Abkühlen der Kamera kann mehrere Minuten dauern, und dies sollte erfolgen, bevor den Mäusen D-Luciferin injiziert wird, um sicherzustellen, dass die Bildgebung 5 Minuten nach der Verabreichung des Substrats stattfinden kann.
- Betäuben Sie bis zu fünf Mäuse in einer Kammer, die 3,5 % (v/v) inhaliertes Isofluran in 1 l/min Sauerstoff liefert. Die Mäuse werden vollständig betäubt, wenn der Rückzugsreflex des Pedals der Hintergliedmaßen verschwunden ist.
- Sobald die Mäuse vollständig anästhesiert sind, verabreichen Sie 100 μl 30 mg/ml D-Luciferin pro Maus (3 mg pro Maus) durch retroorbitale Injektion mit einer 26-g-Nadel. Stellen Sie sich diese Gruppe von Mäusen vor, bevor Sie der nächsten Gruppe D-Luciferin verabreichen. Legen Sie die nächste Gruppe von Mäusen in die Isoflurankammer, um betäubt zu werden, während die vorherige Gruppe abgebildet wird.
- Bildgebung von Luciferase-transduzierten T-Zellen
- Bringen Sie die anästhesierten Mäuse in die lichtdichte Kammer des Imagers und verabreichen Sie weiterhin 3 % Isofluran bei 0,5 l/min. Legen Sie die Mäuse so auf die Seite, dass die Flanke, die das Xenotransplantat trägt, zur Kamera zeigt. Nehmen Sie eine weitere Reihe von Bildern mit den Mäusen in Rückenlage auf, um das Vorhandensein von T-Zellen in der Lunge zu bewerten.
- Wählen Sie in der Erfassungssteuerung die Optionen "Lumineszierend", "Fotografie" und "Überlagerung" aus. Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch, das Binning auf mittel und F/Blende auf 1. Erfassen Sie Bilder. Stellen Sie nach dem ersten Bild die Belichtungszeit so ein, dass sie der entspricht, die für das erste Bild automatisch berechnet wurde, damit die nachfolgenden Bilder direkt verglichen werden können. Es kann nützlich sein, Bilder mit mehreren Belichtungszeiten aufzunehmen, um die optimale Belichtungszeit zu ermitteln, um das hellste Signal ohne Pixelsättigung zu erzielen.
- Nehmen Sie die Mäuse aus dem Isofluran, kehren Sie in ihre Käfige zurück und beobachten Sie, bis sie wach und gehfähig sind.
- Wiederholen Sie die Schritte ab Schritt 4.2.1, bis alle Gruppen abgebildet wurden.
