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>1. Zell- und Parasitenkulturen
- Züchten Sie LLC-MK2-Zellen (Rhesus Monkey Kidney Epithel) aus der American Type Culture Collection (CCL-7) in einem 25 cm großen 2-Zell-Kulturkolben, der im Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium enthält, das mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS (Fetal Bovine Serum) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) bei 37 °C in 5 % Kohlendioxid (CO2)
ergänzt wird.
- Infizieren Sie LLC-MK2-Zellen mit Trypanosoma cruzi (Y-Stamm) gemäß einem früheren Protokoll.
- Sammeln Sie den Überstand der mit LLC-MK2 infizierten Zellen (5 ml) in einem konischen 15-ml-Zellkulturzentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 500 x g für 10 Minuten und 22 °C, um Zelltrümmer zu senken. Halten Sie den Schlauch 10 Minuten lang bei 37 °C, damit die Trypomastigoten zum Überstand schwimmen können.
- Sammeln Sie den Überstand in einem neuen konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn bei 2500 x g für 15 Minuten bei 22 °C. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit den Parasiten in einem vollständigen RPMI-Medium, um die Zelldichte durch Zählen der Zellen in einer Neubauer-Kammer zu bestimmen.
>2. Kontroll-Immunfluoreszenz-Protokoll
HINWEIS: Einmal fixiert, ist es möglich, Platten mit Deckgläsern bei 4 °C in 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,2) für eine Woche zu lagern. Um gelagert zu werden, ist es wichtig, dass die Zellen den Permeabilisierungsschritt nicht durchlaufen haben.
- Delegieren Sie LLC-MK2-Zellen (2 x 104) in 24-Well-Platten mit ultraviolett (UV) sterilisierten, abgerundeten Deckgläsern in RPMI-Medien für 16 Stunden.
- Bei infizierten Zellen wird in jede Vertiefung ein Überstand mit T. cruzi (Pos. 1.4) im Verhältnis (Multiplizität der Infektion, MOI 10:1) gegeben und 6 Stunden nach der Infektion einwirken lassen. Deckgläser, die infizierte und nicht infizierte Zellen enthalten, fünfmal mit PBS-Lösung waschen und mit 2 % Paraformaldehyd in 1x PBS (pH 7,2) für 10 min bei Raumtemperatur (RT) fixieren.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS (pH 7,2).
- Permeabilisieren Sie die Deckgläser mit 0,2% IGEPAL CA-630 (Octylphenoxypolyethoxyethanol) in 1x PBS (PH 7,2) für 10 min bei RT.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Inkubieren Sie Deckgläser 30 min lang bei RT mit der Blockierungslösung (2% Rinderserumalbumin, BSA in 1x PBS, pH 7,2).
- Inkubieren Sie Deckgläser 30 Minuten lang bei RT, entweder mit monoklonalen Maus-Anti-hnRNPA1 (antiheterogenes Ribonukleoprotein-A1) (Verdünnung 1:200) oder mit polyklonalen Maus-Anti-TcFAZ (Anti-Trypanosoma cruzi Flagellum attachment Zone Protein) Antikörpern (Verdünnung 1:100), verdünnt in Blocklösung.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Die Deckgläser werden 30 Minuten lang bei RT mit Ziegen-Anti-Maus-IgG F (ab')2 (H+L) inkubiert, das an Alexa Fluor 488 (1:600) konjugiert ist, zusammen mit Phalloidin, das an Alexa 594 (1:300) konjugiert ist, um Aktinfilamente (F-Aktin) in der Wirtszelle zu färben, die in der Blockierungslösung verdünnt sind.
- Dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 min waschen.
- Tragen Sie eine kleine Menge ProLong Gold Antifading-Eindeckreagenz mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Medium auf die Oberfläche des Objektträgers auf.
- Kippen Sie das Deckglas mit einer Pinzette vorsichtig in das Einbettmedium, um Blasenbildung zu vermeiden. Verschließen Sie nach dem Trocknen das Deckglas, falls gewünscht.
>3. Doppelmarkierungs-Immunfluoreszenzprotokoll unter Verwendung von monoklonalen und polyklonalen Antikörpern, die im selben Wirt gezüchtet
wurden
- Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 2.1 bis 2.6.
- Deckgläser, die infizierte und nicht infizierte Zellen enthalten, werden mit einem hauseigenen polyklonalen Maus-Anti-TcFAZ-Antikörper (1:100) inkubiert, der 30 Minuten lang bei RT in einer Blockierungslösung verdünnt wurde.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Inkubieren Sie Deckgläser 30 Minuten lang bei RT mit Ziegen-Anti-Maus-IgG F (ab')2 (H+L), konjugiert mit Alexa Fluor 647 (1:600), verdünnt in der Blockierungslösung.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Führen Sie den zweiten Blockierungsschritt mit AffiniPure Kaninchen-Anti-Maus-IgG (H+L) verdünnt (0,12 mg/ml) in Blockierungslösung für 30 Minuten bei RT durch.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal mit 1x PBS (pH 7,2) für jeweils 5 min. Dann mit dem monoklonalen Anti-hnRNP A1 IgG2b-Antikörper der Maus (1:200) für 30 Minuten bei RT inkubieren.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Inkubieren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang mit Ziegen-Anti-Maus-IgG2b-Antikörpern, konjugiert an Alexa Fluor 488 (1:600) und mit Phalloidin, konjugiert an Alexa 594 (1:300), verdünnt in der Blockierungslösung.
- Waschen Sie die Deckgläser dreimal für je 5 Minuten mit 1x PBS.
- Wiederholen Sie die oben beschriebenen Schritte 2.8 bis 2.10.