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>1. Antikörperaufreinigung durch Affinitätschromatographie mit einem automatisierten FPLC-System (Fast Protein Liquid Chromatography)
HINWEIS: Das folgende Verfahren kann im Allgemeinen auf die meisten automatisierten Systeme angewendet werden. Die Reinigung kann bei Raumtemperatur oder bei 4 °C durchgeführt werden (wenn das FPLC-System in einem kühlen Raum aufbewahrt wird). Eine Reihe von Scouting-Tests kann durchgeführt werden, um die optimalen Aufreinigungsbedingungen zu identifizieren, einschließlich der geeigneten Säulenmatrix, des Bindungspuffers, des Elutionspuffers und des pH-Werts, um eine maximale Rückgewinnung des gereinigten Antikörpers aus konditionierten Medien zu gewährleisten (siehe Abschnitt "Ergebnisse"). Die optimalen Bedingungen hängen davon ab, welcher Antikörper oder welches Protein aufgereinigt wird. Die Aufreinigungen wurden auf einem automatisierten FPLC-System durchgeführt. Die Aufreinigungen wurden bei Raumtemperatur mit einer 5-ml-Protein-A-Säule durchgeführt.
- Bereiten Sie die folgenden Puffer mit Reinstwasser vor und stellen Sie sie auf den empfohlenen pH-Wert ein, dann filtrieren Sie durch einen 0,22-μm-Filter.
- 1 l phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 (Bindungspuffer) wird durch Mischen von 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 und 0,001 M KH2PO4 hergestellt. Passen Sie den pH-Wert bei Bedarf an, bevor Sie den Puffer filtrieren.
- Bereiten Sie 500 ml 0,1 M Glycin-HCl pH 2,7 (Elutionspuffer) vor. Passen Sie den pH-Wert an, bevor Sie den Puffer filtrieren.
- Bereiten Sie 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (Neutralisationspuffer) vor.
- Stellen Sie sicher, dass alle Stromversorgungs- und Kommunikationsverbindungen des Systems mit dem Computer hergestellt sind. Die Geräte sollten im Softwaremodul "System Control" sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass die UV-Zelle auf eine Wellenlänge von 280 nm eingestellt ist. Optional: Kalibrieren Sie das pH-Messgerät, falls angeschlossen und zu verwenden.
- Tauchen Sie die Einlassrohre von A, B und die Probenpumpe in Reinstwasser, um das System zu waschen. Spülen Sie die Pumpen mit einer Spritze, wenn sich Luft im Schlauch befindet oder der Verdacht besteht, dass sich Luft im System befindet. Waschen Sie das System mit Wasser durch manuelle Bedienung über die Anlagensteuerung oder über eine automatisierte Methode. Es ist zu beachten, dass Druck, Leitfähigkeit, UV280-Abtastung und pH-Wert konstant bleiben und dass die Druckgrenze für die Säule gemäß den Herstellerangaben nicht überschritten wird.
Anmerkung: Anomalien können auf eine Luft- oder Verstopfung im System hinweisen, die behoben werden sollte, bevor Sie fortfahren.
- Starten Sie im System-Controller-Modul die Durchflussrate bei 1 ml/min manuell über Pumpe A in der Last- (unter Umgehung des Probenkreislaufs) oder in der Injektionsposition (durch den Probenkreislauf), um mit dem Anschluss der Säule zu beginnen. Trennen Sie die Systemschläuche am Einlass der Säulenposition und entfernen Sie den mit dem Einlass der Säule verbundenen Stopfen.
- Lassen Sie Wasser tropfenweise aus dem Systemschlauch auf die Säule fließen und befestigen Sie dann den Systemschlauch an der Säule. Das Überlaufen des Säuleneinlasses und der Einlassarmatur mit Wassertropfen sorgt für eine luftblasenfreie Verbindung.
- Bringen Sie den Säulenauslass am nachgeschalteten Auslass an, und vergewissern Sie sich, dass alle Anschlüsse fest angezogen sind. Wenn die Säule nun an das System angeschlossen ist, überschreiten Sie nicht die Grenzwerte für den maximalen Druck und die Durchflussrate, wie in den Säulenspezifikationen beschrieben.
- Waschsäule mit 5 Säulenvolumen (CV) Wasser. Setzen Sie bei Bedarf die Säulenwäsche fort, bis sich die UV280-Ablaufverfolgung stabilisiert hat.
- Tauchen Sie die Einlassröhrchen von A in den Bindungspuffer, B in den Elutionspuffer und die Probenpumpe in den Bindungspuffer, um das System in den richtigen Puffern auszugleichen. Füllen Sie die Einlassrohre mit Puffer mit PumpWash durch manuelle Bedienung.
- Verwenden Sie im Modul 'Method Editor' der Software den Methodenassistenten, um eine Affinitätschromatographie-Methode für die Säule einzurichten, die verwendet werden soll.
Anmerkung: Automatisierte FPLC-Systeme werden mit Methoden geliefert, die mit den empfohlenen Einstellungen (d. h. Durchflussrate und Druckgrenze) und Laufschritten basierend auf der für die Aufreinigung ausgewählten Säule (Hersteller, Matrix und Größe) vorgefüllt sind.
- Führen Sie die folgenden Ausführungsschritte für die Protein-A-Affinitätschromatographie aus:
- Äquilibrieren Sie das System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Sie den Durchfluss in den Abfallbehälter.
- Laden Sie die Probe auf die Säule (das zu ladende Volumen wird manuell in der Methode angegeben) und sammeln Sie den Durchfluss in einem separaten Behälter.
- Waschen Sie das System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Sie den Durchfluss in einen separaten Behälter.
- Eluieren Sie eine Säule mit isokratischer 5-CV-Fraktionierung unter Verwendung von Elutionspuffer und sammeln Sie die gereinigte Antikörperprobe als Fraktionen nach Fraktionssammler.
- Äquilibrieren Sie das System mit 5 CV Bindungspuffer und sammeln Sie den Durchfluss in den Abfallbehälter.
- Nachdem die Methode eingerichtet wurde, geben Sie das Volumen der konditionierten Medien an, die auf die Spalte angewendet werden sollen, und speichern Sie die Methode.
Anmerkung: Das angegebene Volumen in der Methode sollte 5-10 ml kleiner sein als das tatsächliche Volumen, um das Eindringen von Luft während des Probenlaufs zu vermeiden. Das in diesem Protokoll verwendete Volumen beträgt 90-120 ml.
- Tauchen Sie den Schlauch der Probenpumpe in den Behälter mit dem konditionierten Medium.
- Bereiten Sie einen separaten Behälter vor, um den Probendurchfluss über den angegebenen Auslassschlauch zu sammeln.
Anmerkung: Es ist wichtig, den Durchfluss aufzufangen, falls während des Laufs ein Fehler auftritt oder die Bindungskapazität der Säule überschritten wird, so dass der Durchfluss erneut auf die Säule aufgebracht oder die Reinigung wiederholt werden muss.
- Bereiten Sie die Sammelröhrchen im Fraktionssammler vor. 100 μl Neutralisationspuffer pro 1 ml Fraktionsvolumen zugeben. Das FPLC-System eluiert die Fraktionen automatisch in die Sammelröhrchen.
- Öffnen Sie im Modul 'System Control' der Software die Methode, die ausgeführt werden soll.
Anmerkung: Die Ausführung der Methode wird auf einer Reihe von Seiten gestartet, die die Überprüfung der Variablen der Methode, die Einrichtung des Fraktionssammlers und die Definition des Namens der Ergebnisdatei und des Speicherorts umfassen.
- Klicken Sie auf START, um die Ausführung zu starten. Der Lauf kann im Modul 'System Control' überwacht werden.
- Überprüfen Sie nach Abschluss des Aufreinigungslaufs das resultierende Chromatogramm im Modul "Evaluation" in der Systemsoftware.
- Alle proteinhaltigen Fraktionen in ein separates Röhrchen mischen, Puffer austauschen und in PBS mit einer Zentrifugalfiltervorrichtung mit 30 kDa Molekulargewichtsabschaltung konzentrieren. Zentrifugationsschritte gemäß den Anweisungen des Herstellers durchführen.
- Messen Sie die Antikörperkonzentration mit dem Bicinchoninsäure-Assay (BCA) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Wenn ein weiterer Aufreinigungslauf durchgeführt werden soll, entleeren Sie den Schlauch der Probenpumpe in Bindungspuffer und wiederholen Sie die Schritte 1.9-1.14.
- Tauchen Sie nach Abschluss der Reinigungsläufe die Einlassrohre von A, B und der Probenpumpe in Reinstwasser und waschen Sie das System und die Säule wie in Schritt 3 beschrieben.
- Tauchen Sie die Schläuche der A-, B- und Probenpumpe in 20%iges Ethanol und wiederholen Sie den Waschvorgang zur Lagerung des Systems und der Säule.
- Trennen Sie die Säule vom nachgeschalteten Auslass und setzen Sie den Säulenstopfen wieder ein, trennen Sie dann die Säule am Einlass und setzen Sie den Stopfen wieder ein, und schließen Sie die Schläuche wieder an das System an. Die Säule bei 4 °C lagern.