Eine Immunfluoreszenz-Färbetechnik zum Nachweis der adulten Hippocampus-Neurogenese

Zusammenfassung

Quelle: Ansorg, A., et al. Immunhistochemie und Mehrfachmarkierung mit Antikörpern aus derselben Wirtsspezies zur Untersuchung der adulten Hippocampus-Neurogenese. J. Vis. Exp. (2015)

Das Video zeigt eine Immunfluoreszenz-Färbemethode, die zur Untersuchung der Neurogenese im adulten Hippocampus verwendet wird. Zunächst wird ein Schnitt eines Mausgehirns mit primären Antikörpern behandelt, die auf Markerproteine gerichtet sind, die mit der Neurogenese in neuronalen Vorläuferzellen assoziiert sind. Als nächstes wird es mit Sekundärantikörpern markiert, die mit Fluorophoren markiert sind. Der Hirnschnitt wird dann unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet, um verschiedene Subtypen von Vorläuferzellen zu unterscheiden, basierend auf den Expressionsmustern verschiedener Kombinationen von Markerproteinen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Vorbereitung des Gewebes

1. Bereiten Sie 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor der Perfusion vor. Bei 4 °C lagern.
2. Die tief anästhesierten Mäuse (3,5 % Isofluran) werden über den linken Ventrikel transkardial mit 10 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) perfundiert, anschließend mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate 5 ml/min). Präparieren Sie das Gehirn und postfixieren Sie es 24 Stunden lang bei 4 °C ....

Ergebnisse

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Übertragung von Mikrotomscheiben in eine 24-Well-Platte. Beginnen Sie bei A1 und legen Sie die nachfolgenden Scheiben in Reihe A; Nach A6 geht es zur nächsten Zeile B und so weiter. Wenn Sie die D6 erreicht haben, gehen Sie zurück auf die A1 und fahren weiter. Diese Anordnung der Schichten ermöglicht die Quantifizierung jedes^n-ten Abschnitts ein.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vorbereitung des Gewebes
Isofluran-Actavis	Piramal Gesundheitswesen	700211
Paraformaldehyd-Pulver (PFA)	Riedel-De Häen	Nr. 16005	giftig, brennbar
Perfusionspumpe PD5206	Heidolph Instrumente	Artikel-Nr.: 523-52060-00
Masterflex Tygon Laborschlauch, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	Tel.: 06409-13
Zuführnadel, gerade, 21 G, 1,75 mm olivfarbene Spitze, 40 mm	Agnthos	Nr. 1036
Gefriermikrotom Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
24-Well-Zellkultur-Multiwell-Platten	Greiner Bio-One	Artikel-Nr.: 662160
Immunhistochemie
Tefal vitacuisine Dampfgarer	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze	Corning	Artikel-Nr.: 3479	vorgeladen in 6-Well-Kulturplatten
Netwell 15 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze	Corning	Artikel-Nr.: 3477	vorgeladen in 12-Well-Kulturplatten
Netwell 6-Well-Träger-Kit aus Kunststoff	Corning	3521	für 24 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze
Netwell 12-Well-Träger-Kit aus Kunststoff	Corning	3520	für 15 mm Polyester-Mesh-Membraneinsätze
Vectastain Elite ABC Bausatz	Vector Laboratorien	PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidintetrahydrochloridhydrat)	Sigma-Aldrich	Nr. D-5637	krebserregend, lichtempfindlich
Fluormount-G	SouthernBiotech	Tel.: 0100-01
Primäre Antikörper
Kaninchen IgG1 α-Ki67
Kaninchen α-GFAP, AS-3-GF	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-KI67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; Epitop-Abruf erforderlich
IgG (H+L) α-GFP für Ziegen	Synaptische Systeme	Tel.: 173 002	09:20 Uhr
Maus IgG1 α-nestin	Acris Antikörper und Ähnliche Produkte	Nr. R1091P	06:00
Meerschweinchen IgG (H+L) α-Doublecortin	Abcam (Englisch	AB6142	1:200; erfordert Epitop-Abruf
Ratte IgG2a α-BrdU (Aszites)	Merck Millipore	AB2253	09:20 Uhr
Ratte IgG2a α-BrdU (gereinigt)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	zum Nachweis von BrdU; DAB 1:500/WENN 1:400
Maus IgG1κ α-BrdU	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	zum Nachweis von CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Maus IgG1 α-NeuN	BD Biowissenschaften	Artikel-Nr.: 347580	zum Nachweis von IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Sekundäre Antikörper	Merck Millipore	MAB377	09:20 Uhr
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-Biotin
Esel α-Ratte IgG (H+L)-Biotin	Dianova	Tel.: 711-065-152	09:20 Uhr
Esel α-Maus IgG (H+L)-Biotin	Dianova	Tel.: 712-065-150	09:20 Uhr
Ziegen α-Ratte IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Dianova	Tel.: 715-065-151	09:20 Uhr
Esel α-Ziege IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Molekulare Sonden	Nr. A11006	05:10 Uhr
Esel α-Maus IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Molekulare Sonden	Nr. A11055	05:10 Uhr
Esel α-Maus IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	Artikel-Nr.: 715-097-003	02:40 Uhr
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	Tel.: 715-605-151	05:10 Uhr
Esel α-Ratte IgG (H+L)-Rhodamin Rot-X	Dianova	Tel.: 706-605-148	05:10 Uhr
Esel α-Kaninchen IgG (H+L)-Rhodamin Red-X	Dianova	Tel.: 712-295-150	05:10 Uhr
Esel α-Meerschweinchen IgG (H+L)-Rhodamin Red-X	Dianova	Tel.: 711-295-152	05:10 Uhr
Streptavidin-Rhodamin Rot-X	Dianova	Tel.: 706-296-148	05:10 Uhr
Ziegen α-Kaninchen IgG (H+L)-AMCA	Dianova	Tel.: 016-290-084	09:20 Uhr
Hoechst 33342	Dianova	Tel.: 111-155-144	1:250, funktioniert nur mit Rabbit α-GFAP
DAPI	Molekulare Sonden	Nr. H3570	17:40 Uhr
blockierend	Molekulare Sonden	Nr. D1306	17:40 Uhr
Fab-Fragment Esel α-Maus IgG (H+L)
Fab-Fragment Esel α-Kaninchen IgG (H+L)	Dianova	Artikel-Nr.: 715-007-003	01:20 Uhr
Normales Eselserum	Dianova	Artikel-Nr.: 711-007-003	01:20 Uhr
Normales Kaninchenserum	Merck Millipore	Nr. S30
Normales Ziegenserum	Dianova	Tel.: 011-000-010
Rinderserumalbumin	Dianova	Artikel-Nr.: 005-000-001
Histologie	Sigma-Aldrich	Nr. A7906
Cresylviolett
Neo-Klar	Sigma-Aldrich	Nr. C5042
Neo-Halterung	Merck Millipore	109843	ungiftiger Xylol-Ersatz
Mikroskopie	Merck Millipore	109016	Permanentes Einbettmedium
Axioskop 2
LSM 710	Carl Zeiss Mikroskopie
	Carl Zeiss Mikroskopie

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