Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Vorbereitung des Gewebes
- Bereiten Sie 4% Formaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 am Tag vor der Perfusion vor. Bei 4 °C lagern.
- Die tief anästhesierten Mäuse (3,5 % Isofluran) werden über den linken Ventrikel transkardial mit 10 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) perfundiert, anschließend mit 40 ml eiskaltem Formaldehyd (Durchflussrate 5 ml/min). Präparieren Sie das Gehirn und postfixieren Sie es 24 Stunden lang bei 4 °C mit demselben Fixiermittel.
- Übertragen Sie das Gehirn nacheinander in 10% (24 Std. bei 4°C) und 30% Saccharose (bis das Gehirn absinkt, ca. 48 Std.). Tauchen Sie zum Einfrieren das kryogeschützte Gehirn langsam in -25 °C heißes Isopentan, bis keine Blasen mehr aus dem Gewebe austreten. Bei -80 °C lagern.
- Schneiden Sie koronale Schnitte von 40 μm Dicke auf einem Gefriermikrotom (Blocktemperatur bei -25 bis -16 °C). Die Schnitte werden nacheinander in eine Frostschutzlösung überführt, die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte enthält (siehe Abbildung 1). Bei -20 °C lagern.
>2. Immunfärbung
HINWEIS: Die Abschnitte werden frei schwebend verarbeitet, normalerweise in 6-Well-Platten, die mit einer Trägerplatte und Netzeinsätzen ausgestattet sind. Als Ausnahme werden Blockierung, Antikörperinkubationen und Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Reaktionen in 12- oder 24-Well-Platten ohne Netzeinsätze durchgeführt (0,5 bis 1 ml pro Well sind ausreichend, abhängig von der Anzahl der Scheiben, die gefärbt werden müssen). Übertragen Sie bei diesen Schritten die Abschnitte mit Hilfe einer feinen Bürste (spülen Sie mit jeder neuen Lösung nach). Alle Inkubationen werden unter kontinuierlichem Rühren (max. 150 U/min) durchgeführt.
- Immunhistochemie (ABC-Methode)
- Übertragen Sie die Abschnitte vom Frostschutzmittel in die tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) und spülen Sie sie gründlich aus (einmal O/N bei 4 °C, 5 Mal bei Raumtemperatur [RT] für jeweils 10 Minuten), um das Frostschutzmittel vollständig zu entfernen.
- Um die endogene Peroxidaseaktivität zu stillen, inkubieren Sie 30 Minuten lang in 1,5 % H2O2 in TBS-Tween 20 (TBS-T). Achten Sie auf Blasenbildung und tauchen Sie die Abschnitte gegebenenfalls wieder ein. 3 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS spülen.
- Optional: In der Zwischenzeit einen Wärmeschrank und 2 N HCl auf 37 °C vorheizen. Zur Denaturierung der DNA werden die Schnitte 30 min lang bei 37 °C in 2 N HCl inkubiert. Die Schnitte werden mit Hilfe eines Pinsels vorsichtig voneinander getrennt.
- Optional: Neutralisieren Sie die Abschnitte für 10 min in 0,1 M Boratpuffer pH 8,5, RT. Während des Transfers die Netzeinsätze mit den Abschnitten kurz auf einem Papiertuch abtupfen, um HCl-Reste zu entfernen. 2 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS spülen.
- Inkubieren Sie in TBSplus, um das Gewebe zu permeabilisieren und unspezifische Antikörperbindungsstellen für 1 Stunde bei RT zu blockieren.
- Inkubieren Sie in einem in TBSplus verdünnten Primärantikörper, O/N bei 4 °C. Spülen Sie ihn 3 Mal für jeweils 15 min in TBS.
- Inkubieren Sie in biotinylierten Sekundärantikörpern, verdünnt in TBSplus, für 3 Stunden bei RT. Spülen Sie 3 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS. Inzwischen...
- Bereiten Sie den ABC-Komplex gemäß dem Protokoll des Herstellers vor (1% A + 1% B in TBS-T). Vor Gebrauch 30 min bei RT stehen lassen. Inkubieren Sie die Abschnitte 1 Stunde lang bei RT in AB-Reagenz. Spülen Sie 3 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS.
- Bereiten Sie 50 ml 0,5 mg/ml 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) in TBS-T pro 6- oder 12-Well-Platte vor, teilen Sie sie in zwei Hälften, und pipettieren Sie 4 ml bzw. 2 ml pro Well. Übertragen Sie die Abschnitte in die DAB-Lösung (VORSICHT! DAB ist giftig. Befolgen Sie die vom Lieferanten bereitgestellten spezifischen Sicherheitsdatenblätter, d. h. tragen Sie einen Laborkittel und Handschuhe und verwenden Sie einen chemischen Abzug).
- 0,5 ml 1 % H2O2 zu den verbleibenden 25 ml DAB-Lösung geben, mischen und pipettieren Sie die äquivalenten Volumina wie oben beschrieben in jede Vertiefung, um die Peroxidasereaktion zu starten. 12 Min. inkubieren. 3 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS spülen.
- Montieren Sie die Abschnitte auf Dias in Gelatine und lufttrocknendem O/N. Deckglas mit permanentem Eindeckmedium.
- Optional: Vor dem Anbringen des Deckglases eine Gegenbeize auftragen.
Anmerkung: Wenn das Signal-Rausch-Verhältnis aufgrund des hohen Hintergrunds niedrig ist, wiederholen Sie die H2O2 -Behandlung nach der Inkubation mit AB-Reagenz (Schritt 2.1.8).
- Multifache Immunfluoreszenz
- Einmalige oder gleichzeitige mehrfache Immunfluoreszenz
- Übertragen Sie die Abschnitte vom Frostschutzmittel in TBS und spülen Sie gründlich aus (einmal O/N bei 4 °C, 5 Mal bei RT für jeweils 10 Minuten), um das Frostschutzmittel vollständig zu entfernen.
- Optional: wie in den Schritten 2.1.3 - 2.1.4.
- Inkubieren Sie in TBSplus, um das Gewebe zu permeabilisieren und unspezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren, 1 Stunde bei RT.
- Inkubieren Sie in einem primären Antikörpercocktail (z. B. Ratten-α-BrdU (Bromodeoxyuridin), Meerschweinchen-α-DCX (Doublecortin), Ziegen-α-GFP (grün fluoreszierendes Protein)), verdünnt in TBSplus, O/N bei 4 °C. 3-mal 15 Minuten lang in TBS spülen.
- Inkubieren Sie in einem Cocktail aus Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörpern (z. B. Rhodaminrot α-Ratte, Alexa-647 α-Meerschweinchen, Alexa-488 α-Ziege; alle aus Esel) verdünnt in TBSplus, 3 Std. bei RT oder O/N bei 4 °C. Schützen Sie ab sofort Abschnitte vor Licht. 3 Mal für jeweils 15 Minuten in TBS spülen.
- Montieren Sie die Abschnitte in Gelatine auf Objektträger und trocknen Sie sie über Nacht an der Luft (O/N). Deckglas mit wässrigem Eindeckmedium.
- Sequentielle multiple Immunfluoreszenz mit Primärantikörpern derselben Wirtsspezies
- Wie in den Schritten 2.2.1.1 - 2.2.1.3.
- Inkubieren Sie im ersten primären Antikörper (z. B. Kaninchen-α-Antigen A), O/N bei 4 °C. Spülen Sie 3 Mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Sie in einem ersten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (z. B. Rhodamin Red-conj. Esel α-Kaninchen), 3 Stunden RT. Schützen Sie ab sofort Abschnitte vor Licht. 3 Mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min spülen.
- Inkubieren Sie in 10 % normalem Serum aus demselben Wirt wie die primären Antikörper (z. B. Kaninchenserum) für 3 Stunden RT, um offene Paratope auf dem ersten Sekundärantikörper zu sättigen. 3 Mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 min spülen.
- Inkubieren Sie in TBSplus mit 50 μg/ml unkonjugierten monovalenten Fab-Fragmenten, die gegen den Wirt der primären Antikörper (z. B. α-Kaninchen-IgG (H+L)) gerichtet sind, um Epitope abzudecken, die mit dem zweiten sekundären Antikörper, O/N bei 4 °C, erkannt werden konnten.
- Spülen Sie mindestens 3 Mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 Minuten. Tupfen Sie während des Transfers die Netzeinsätze mit den Abschnitten kurz auf ein Papiertuch, um alle Fab-Reste zu entfernen.
- Inkubieren Sie in einem zweiten Primärantikörper (z. B. Kaninchen-α-Antigen B), O/N bei 4 °C. Spülen Sie 3 Mal in TBS und einmal in TBS-T für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Sie in einem zweiten Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (z. B. Alexa-488-conj. Esel α-Kaninchen), 3 Std. RT. 3 Mal in TBS für je 15 min spülen, montieren und wie oben abdecken.
Anmerkung: Um Antigene mit Antikörpern aus verschiedenen Wirtsspezies zu markieren, fügen Sie diese in Schritt 2.2.2.2 und die entsprechenden Sekundärantikörper in Schritt 2.2.2.3 hinzu.
