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>1. Vorbereitung von Tieren
- Betäuben Sie die Mäuse mit 3% Isofluran. Öffne die Brust, indem du einen horizontalen Schnitt im Bereich über dem Mittelbauch machst und an der Haut ziehst. Machen Sie vorsichtig einen weiteren Schnitt, um die Brusthöhle zu öffnen, ohne andere Organe zu durchstechen.
- Perfundieren Sie zuerst das Herz durch die Spitze und dann den rechten Ventrikel mit kaltem 3%igem Glutaraldehyd in kardioplegischer Lösung (50 mM KCl, 5% Dextrose in PBS, siehe Tabelle 1) für 2 Minuten, um eine vollständige Myokardentspannung zu gewährleisten.
- Perfundieren Sie das Herz mit eiskaltem 3%igem Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (pH 7,4) für weitere 2 Minuten. Verwenden Sie unter Schwerkraft eine 25 G 5/8" Nadel, um die Fixiermittel in das Herz einzuführen. Unmittelbar nachdem sich das Herz mit dem Fixiermittel zu füllen beginnt, heben Sie die Spitze des Herzens an und schneiden Sie die darunter liegenden Gefäße in einem Abstand von 1-2 mm zum Herzen, um den Druck zu verringern und die Flüssigkeit abfließen zu lassen.
- Präparieren Sie das Herz, entfernen Sie die Vorhöfe und lassen Sie die Ventrikel in eiskaltes 3%iges Glutaraldehyd/0,1 M Natriumcacodylat in einer Petrischale fallen. Machen Sie nach 30-60 Minuten Fixierung einen Schmetterlingsschnitt und legen Sie ihn in eine Petrischale, die 3% Glutaraldehyd/Cacodylat enthält (siehe Materialtabelle). Schneiden Sie das Herz mit einer chirurgischen Klinge in kleine Würfel von 1 mm3, während es sich in Glutaraldehyd/Cacodylat-Lösung befindet.
- Fixieren/Tauchen Sie das präparierte Herzgewebe für 24 Stunden bei 4 °C in Glutaraldehyd/Cacodylat-Lösung.
>2. Verarbeitung von Herzgewebe
- Waschen Sie das Gewebe nach 24 Stunden Fixierung 20 Minuten lang in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer.
- Bereiten Sie 0,1 M Cacodylatpuffer vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Zur Herstellung von 0,1 M Natriumcacodylatpuffer bereiten Sie einen Vorrat von 1 M Natriumcacodylatpuffer vor, indem Sie Natriumcacodylat (21,4 g) und 1% ige Calciumchloridlösung (3 ml) in 90 mL destilliertem Wasser auflösen. Erhöhen Sie die Lautstärke der Lösung auf 100 ml, indem Sie das destillierte Wasser hinzufügen. Rühren Sie die Lösung gut um und lassen Sie sie über Nacht einwirken, um den gelösten Stoff aufzulösen.
- Nehmen Sie als nächstes 10 ml 1 M Natriumcacodylat-Stammlösung und geben Sie sie zu 80 ml destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein und erhöhen Sie ihn durch Zugabe von destilliertem Wasser auf 100 mL.
- Wiederholen Sie die Wäsche in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer für weitere 20 Minuten. Entfernen Sie das Gewebe aus dem Natriumcacodylatpuffer und tauchen Sie es 4 h lang bei Raumtemperatur in 2%ige Osmiumtetroxidlösung. Dieser Vorgang wird als Osmikation bezeichnet.
- Bereiten Sie eine 2%ige Osmiumtetroxidlösung vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Zur Herstellung einer 2%igen Osmiumtetroxidlösung nehmen Sie 4%ige Osmiumtetroxidlösung, 4 mL (siehe Materialtabelle), 1 M Natriumcacodylat-Stammlösung (0,8 mL) und destilliertes Wasser (3,2 mL), um insgesamt 8 mL Lösung herzustellen.
Anmerkung: Dieser gesamte Vorgang und die Schritte von nun an müssen im Abzug durchgeführt werden.
- Tauchen Sie das Gewebe nach der Osmikation 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in 2%ige Natriumacetatlösung.
- Bereiten Sie eine 2%ige Natriumacetatlösung her, indem Sie 4 g Natriumacetat in 20 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Tauchen Sie anschließend das Gewebe 1 h lang bei Raumtemperatur in 2%ige Uranylacetatlösung.
- Bereiten Sie eine 2%ige Uranylacetatlösung her, indem Sie 4 g Uranylacetat in 20 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Nach der Uranylacetat-Färbung wird das Gewebe nacheinander durch die abgestuften Alkohole und das Aceton in der in Tabelle 2 genannten Reihenfolge dehydriert.
>3. Einbettung von Herzgewebe
- Betten Sie das dehydrierte Gewebe in niedrigviskoses Epoxidharz ein, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Um niedrigviskoses Epoxidharz herzustellen, mischen Sie 10,24 ml Vinylcyclohexendioxid-Epoxidmonomer, 6,74 ml Diglycidylether von Polypropylenglykol (DER 732) und 30,05 ml Nonenylbernsteinsäureanhydrid (NSA) (siehe Materialtabelle) in einem 50-ml-Röhrchen. Rühren Sie die Suspension 2 min lang gut mit der Hand um.
- Fügen Sie 18 Tropfen 2-Dimethylaminoethanol (DMAE, siehe Materialtabelle) Epoxidbeschleuniger hinzu und rühren Sie die Suspension um, um die Komponenten gründlich zu mischen.
- Imprägnieren Sie das Gewebe in Epoxidharz in der folgenden Reihenfolge der Mischung.
- Ersetzen Sie das 100%ige Aceton durch eine 1:1-Harz-Aceton-Suspension und tauchen Sie das Gewebe 1 h lang bei Raumtemperatur darin.
- Ersetzen Sie das 1:1-Harz: Aceton-Suspension durch das 6:1-Harz: Aceton-Suspension und tauchen Sie das Gewebe 3 h lang darin.
- Ersetzen Sie schließlich die 6:1-Harz-Aceton-Suspension durch eine 100%ige Harzsuspension und lassen Sie das Gewebe über Nacht bei Raumtemperatur darin eingetaucht.
- Legen Sie die Gewebe in frisches Harz in 8 mm Mikroformen (siehe Materialtabelle) und härten Sie das eingebettete Gewebe über Nacht bei 70 °C aus.
Anmerkung: Achten Sie darauf, dass das Harz nach dem Aushärten hart, aber nicht spröde ist.
>4. Gewebeschnitt mit einem Ultramikrotom
- Schneiden Sie die Harzblöcke mit dem Gewebe auf nicht mehr als 1 mm ab, bevor Sie sie auf das Ultramikrotom montieren (siehe Materialtabelle). Platzieren Sie die Form so präzise wie möglich in den segmentierten Arm des Ultramikrotoms und schieben Sie die Probenform manuell in Richtung des Diamantmessers.
- Schneiden Sie die Schnitte mit einer Dicke von 500 nm (ein halbes Mikron) mit einem Histo-Messer (siehe Materialtabelle) und nehmen Sie sie mit dem EM-Schlaufenwerkzeug auf und legen Sie sie auf einen Objektträger.
- Legen Sie den Objektträger auf eine heiße Platte, um Toluidinblau zu färben, um den gewünschten Bereich zu finden.
- Nachdem Sie den interessierenden Bereich gefunden haben, verwenden Sie ein Ultra-45°-Messer (siehe Materialtabelle), um ultradünne Schnitte aus blassem Gold (100 nm) herzustellen. Platzieren Sie diese ultradünnen Abschnitte auf der stumpfen Seite eines 200-Mesh-Kupfergitters.
>5. Ultradünne Färbung von Herzschnitten
- Beginnen Sie die Färbung, indem Sie das Antigen mit einer Ätzlösung, d. h. einer 5%igen Natriummetaperiodatlösung, demaskieren.
- 500 μl 5%ige Natriummetaperiodatlösung (siehe Materialtabelle) in destilliertem Wasser herstellen.
Anmerkung: Bereiten Sie vor Gebrauch eine frische Lösung vor.
- Geben Sie 20 μl Natriummetaperiodatlösung auf einen sauberen Paraffinfilm. Legen Sie die vollständig getrockneten Gitter mit den Gewebeschnitten auf das Tröpfchen der Ätzlösung.
Anmerkung: Die stumpfe Seite des Gitters mit dem Gewebeschnitt muss zur Ätzlösung zeigen.
- Lassen Sie das Gitter 30 min bei Raumtemperatur auf der Lösung.
- Waschen Sie den geätzten Gewebeabschnitt, indem Sie ihn 60 s lang auf einen Tropfen destillierten Wassers legen.
- Blockieren Sie die restlichen Aldehyde, indem Sie die Schnittgitter 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Tropfen 0,05 M Glycinlösung legen. Tupfen Sie die Ränder des Gitters auf Filterpapier ab, um die restliche Glycinlösung zu entfernen.
- Bereiten Sie 0,05 M Glycinlösung vor (siehe Materialtabelle), indem Sie 3,75 mg Glycin in 1 ml 1x PBS (pH 7,4) auflösen.
- Legen Sie die Schnittgitter für 25 min bei Raumtemperatur in 10-20 μl Blocklösung.
Anmerkung: Zusammensetzung der Blockierungslösung: 2 μl 1 % normales Ziegenserum (NGS) + 20 μl 1 % BSA (Endkonzentration: 10 %) + 178 μl 1x PBS (pH 7,4), um ein Endvolumen von 200 μl zu erhalten.
- Tupfen Sie die Gitterränder auf Filterpapier ab und legen Sie den Gitterabschnitt zur Konditionierung bei Raumtemperatur für 10 min auf Antikörperverdünnungsmittel.
- Inkubieren Sie die Gitterabschnitte mit dem Primärantikörper (in diesem Fall Sigmar1, siehe Materialtabelle; verdünnt 1:10 in Antikörperverdünnungsmittel) für 1 h 30 min in einer befeuchteten Kammer.
- Tupfen Sie das Gitter trocken und waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils 5 min mit Antikörperverdünnungsmittel.
- Die Gitterabschnitte werden 1 h lang in einer befeuchteten Kammer mit biotinylierten Sekundärantikörpern (in diesem Fall biotinylierter polyklonaler Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper, siehe Materialtabelle; 1:10 in Antikörperverdünnungsmittel verdünnt) inkubiert.
- Tupfen Sie das Gitter trocken und waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils 5 min mit Antikörperverdünnungsmittel.
- Inkubieren Sie die Gitterabschnitte in kommerziell erhältlicher Streptavidin-konjugierter QD (QD655 nm, siehe Materialtabelle; verdünnt 1:10 in Antikörperverdünnungsmittel) für 1 h in einer befeuchteten Kammer bei Raumtemperatur. Verhindern Sie Lichteinwirkung, indem Sie die Kammer mit Alufolie abdecken.
- Die Gitterränder mit Filterpapier trocken tupfen und die Gitterteile waschen, indem Sie sie 2 Min. auf Wassertropfen legen.
- Tupfen Sie die Ränder des Gitters zum Trocknen ab.
Tabelle 1: Zusammensetzung von PBS und anderen Lösungen, die zur Dehydrierung des Gewebes verwendet werden.
ein.
| Puffer | Zusammensetzung | Menge |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x) (1 L) | Natriumchlorid | 8 g |
| Kaliumchlorid | 0,2 g |
| Natriumphosphat zweibasisch | ca. 1,44 g |
| Kaliumphosphat einbasisch | 0,24 g |
| Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 | |
Tabelle 2: Anwendung von abgestuftem Alkohol und Aceton zur Dehydrierung des Gewebes (Schritt 2.5)
| Bestandteil | Zeit |
| 50% Ethanol | ca. 10 Minuten |
| 70% Ethanol | ca. 10 Minuten |
| 95% Ethanol | ca. 10 Minuten |
| 100% Ethanol | ca. 20 Minuten |
| 100% Ethanol | ca. 20 Minuten |
| 100% Aceton | 30 Minuten |
| 100% Aceton | 30 Minuten |