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Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.
>1. Tierpräparation und Nierenfixierung
- Führen Sie die Perfusionsfixation mit den folgenden Schritten durch.
- Anästhesieren Sie die Maus durch Inhalation von Isofluran (3%, 2,0 l/min) und intraperitoneale Verabreichung von Medetomidinhydrochlorid (0,3 mg/kg), Butorphanoltartrat (5 mg/kg) und Midazolam (4 mg/kg) (siehe Materialtabelle).
- Perfundieren Sie das Tier mit 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) und 30 ml 4 % Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer (PB) über den linken Ventrikel des Herzens.
- Führen Sie die Immersionsfixation unmittelbar nach der Perfusionsfixierung und der Nierenprobenahme durch.
- Tauchen Sie die Niere weitere 16 Stunden lang in 4 % PFA bei 4 °C und waschen Sie sie dann 2 Stunden lang (dreimal) mit PBS9 (Abbildung 1).
Vorsicht: Formaldehyd und Paraformaldehyd sind giftige Reizstoffe. Behandeln Sie die Reagenzien in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung.
>2. Entfärbung und Entfettung
- Bereiten Sie CUBIC-L (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) für die Entfärbung und Entfettung vor, bestehend aus 10 Gew.-% Triton X-100 und 10 Gew.-% N-Buthyldiethanolamin (siehe Materialtabelle), gemäß zuvor veröffentlichten Berichten.
- Führen Sie die Entfärbung und Entfettung mit CUBIC-L durch, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Tauchen Sie die fixierte Niere in 7 ml 50 % (v/v) CUBIC-L (1:1 Gemisch aus Wasser und CUBIC-L) in ein 14 mL Röhrchen mit rundem Boden (siehe Materialtabelle) unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur für 6 Stunden (Abbildung 2A). Tauchen Sie es dann 5 Tage lang in 7 mL CUBIC-L in ein 14-ml-Röhrchen mit rundem Boden und schütteln Sie es leicht bei 37 °C.
- Aktualisieren Sie während dieses Vorgangs jeden Tag den CUBIC-L. Nach dem Entfärbungs- und Entfettungsprozess waschen Sie die Niere 2 h lang (dreimal) mit PBS bei Raumtemperatur (Abbildung 1). Verwenden Sie für die Probenhandhabung einen Dispensierlöffel (Abbildung 2B).
>3. Ganzfassungs-Immunfluoreszenzfärbung
- Bereiten Sie die Färbepuffer vor.
- Bereiten Sie den Färbepuffer für Primärantikörper vor, indem Sie 0,5 % (v/v) Triton X-100, 0,5 % Kasein in PBS und 0,05 % Natriumazid mischen.
- Bereiten Sie den Färbepuffer für Sekundärantikörper vor, indem Sie 0,5 % (v/v) Triton X-100, 0,1 % Kasein in PBS und 0,05 % Natriumazid mischen.
- Führen Sie die Färbung mit Primärantikörpern durch.
- Immunfärbung der entfetteten Niere mit Primärantikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 7 Tage.
Anmerkung: Die Menge des Färbepuffers, die für eine Niere benötigt wird, beträgt 500-600 μl (Abbildung 2C).
- Waschen Sie die Niere 1 Tag lang mit 0,5 % (v/v) Triton X-100 in PBS (PBST) bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
- Führen Sie die Färbung mit Sekundärantikörpern durch.
- Immunfärbung der Niere mit Sekundärantikörpern (1:100 oder 1:200, siehe Materialtabelle) im Färbepuffer bei 37 °C unter leichtem Schütteln für 7 Tage. Waschen Sie die Niere 1 Tag lang mit PBST bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
- Tauchen Sie die Niere nach der Fixierung 3 h lang in 1 % Formaldehyd in PB (1:36 Mischung aus 37 % Formaldehyd und PB) und waschen Sie sie 6 h lang mit PBS bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
>4. Anpassung des Brechungsindex (RI)
- CUBIC-R+ vorbereiten.
- CUBIC-R wird durch Mischen von 45 Gew.-% 2,3-Dimethyl-1-phenyl-5-pyrazolon/Antipyrin und 30 Gew.-% Nicotinamid gemischt (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie CUBIC-R+ für die Anpassung des Brechungsindex (RI) vor, indem Sie 0,5 v% N-Buthyldiethanolamin zu CUBIC-R gemäß den zuvor veröffentlichten Berichten hinzufügen.
- Führen Sie den RI-Abgleich durch.
- Tauchen Sie die Niere in 7 ml 50 % (v/v) CUBIC-R+ (1:1-Mischung aus Wasser und CUBIC-R+) in ein 14 ml-Röhrchen mit rundem Boden und schütteln Sie es 1 Tag lang bei Raumtemperatur leicht. Tauchen Sie es dann in 7 mL CUBIC-R+ in ein 14 mL Röhrchen mit rundem Boden und schütteln Sie es 2 Tage lang bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
Anmerkung: Obwohl die Niere zu Beginn des RI-Matchings in 50 % CUBIC-R+ schwimmt, sinkt sie ab und wird am Ende des Prozesses in CUBIC-R+ transparent (Abbildung 2D).
>5. Bilderfassung und -rekonstruktion
- Tauchen Sie die RI-angepasste Niere während der Bildaufnahme (RI = 1,555) in eine Mischung aus Silikonöl (RI = 1,555) und Mineralöl (RI = 1,467) (55:45) (Abbildung 3).
- Nehmen Sie 3D-Bilder der gesamten Niere mit einem speziell angefertigten Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskop auf (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie alle Rohbilddaten in einem 16-Bit-TIFF-Format. Visualisieren und erfassen Sie die 3D-gerenderten Bilder mit der Bildanalysesoftware (Imaris, siehe Materialtabelle).
