Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt,
>1. Entnahme von Hautbiopsien
- Lassen Sie die Hautbiopsie von einem qualifizierten Arzt in einer geeigneten klinischen Umgebung durchführen.
- Wählen Sie den Bereich aus, in dem die Hautbiopsie durchgeführt werden soll, und reinigen Sie ihn mit einem Alkoholtupfer.
- Bereiten Sie die Anästhesielösung mit 1 ml Lidocain 2% vor.
- Injizieren Sie mit der Nadel parallel zum Bereich eine Lokalanästhesie subkutan
.
- Nachdem Sie die Wirkung der Anästhesie überprüft haben, nehmen Sie den 3-mm-Einwegstempel und üben Sie einen rotierenden und sanften Abwärtsdruck aus, um ihn durch die Epidermis und Dermis nach unten zu rotieren, bis das subkutane Fett erreicht ist.
- Ziehe den Locher zurück.
- Ziehe den Hautstopfen mit einer Einwegzange vorsichtig nach oben.
- Schneiden Sie mit einer Schere die Basis der Probe auf Höhe des Fettgewebes aus.
- Legen Sie die Probe in ein Röhrchen mit 10 ml Fixierlösung aus Periodat-Lysin-Paraformaldehyd (PLP).
- Desinfizieren Sie den Bereich und decken Sie ihn mit einem Pflaster ab.
>2. Gewebefixierung und -lagerung
- Stellen Sie eine frische PLP-Fixierlösung her (siehe Tabelle 1).
- Unmittelbar nach der Entnahme der Hautbiopsie wird sie in ein Röhrchen mit 10 ml PLP-Fixierlösung getaucht und über Nacht (O/N) bei 4 °C inkubiert.
- Entfernen Sie am nächsten Tag unter dem Abzug vorsichtig das PLP-Fixiermittel und waschen Sie die Biopsie 3 Mal für 5 Minuten mit 5 ml 0,1 M Sorensen-Lösung (Tabelle 1).
- Verwerfen Sie die Sorensen-Lösung und inkubieren Sie die Biopsie mit 5 mL Kryoschutzlösung O/N bei 4 °C.
- Lagern Sie die Biopsie bei 4 °C, wenn der Schnitt mit einem Kryotom innerhalb von 1 Woche durchgeführt wird; lagern Sie die Biopsie bei -20 °C, wenn der Schnitt innerhalb von 3 Monaten durchgeführt wird; betten Sie die Biopsie in einen Kryoformen ein (Schritte 3.2-3.4) und lagern Sie sie bei -80 °C, um sie für einen längeren Zeitraum zu konservieren.
>3. Gewebeschnitt mit einem Kryotom
- Stellen Sie das Kryotom auf -20 °C ein.
- Nehmen Sie eine Kryoform und füllen Sie sie mit dem Kryo-Einbettungsmedium. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen.
- Tauchen Sie die Biopsie mit einer Pinzette in das Kryo-Einbettungsmedium ein, wobei die Längsachse (Epidermis - Dermis) parallel zum Boden des Kryomolds verläuft.
- Frieren Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um einen festen Würfel aus Kryo-Einbettungsmedium zu erhalten, der die Biopsie in der richtigen Ausrichtung enthält.
- Geben Sie die Probe in den Kryostaten und warten Sie 30 Minuten, damit sich die Biopsie akklimatisieren kann.
- Fixieren Sie die Probe auf dem Kryostaten und schneiden Sie 50 μm große Abschnitte.
- Übertragen Sie die Kryo-Schnitte mit Hilfe eines kleinen Pinsels in eine 96-Well-Platte, die 200 μl Frostschutzlösung enthält. Ein Abschnitt pro Vertiefung.
- Bei -20 °C lagern.
Anmerkung: Wenn bei der Analyse nicht die gesamte Biopsie analysiert wird, schneiden Sie sie nur teilweise ab. In diesem Fall müssen die Schnitte bei -20 °C und der restliche Teil der Biopsie bei -80 °C gelagert werden, um sie über einen längeren Zeitraum zu konservieren.
>4. Immunfluoreszenz-Färbung
- Füllen Sie eine 96-Well-Platte mit 100 μl Waschlösung.
- Übertragen Sie die zu analysierenden Schnitte von der Lagerplatte auf die neue Platte, die die Waschlösung enthält. 1 Schnitt pro Vertiefung (4 Schnitte pro anatomischer Stelle, pro Patient: in der Regel insgesamt 12 Schnitte pro Patient).
- Lassen Sie den Abschnitt 10 Minuten bei Raumtemperatur (RT) in der Waschlösung. Übertragen Sie den Abschnitt in eine andere Vertiefung mit der gleichen Lösung und wiederholen Sie den Waschvorgang.
- Die Schnitte werden in neue Vertiefungen mit 100 μl Blockierungslösung umgefüllt und mindestens 90 Minuten und maximal 4 Stunden bei RT inkubiert.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper anti-PGP9.5 (Kaninchen polyklonal, 1:1000) und anti-5G4 (Maus monoklonal, 1:400) in der Arbeitslösung.
- Die Schnitte werden in neue Vertiefungen mit 100 μl der Arbeitslösung der Primärantikörper überführt und bei RT O/N inkubiert.
- Waschen Sie die Abschnitte wie in Schritt 4.3 2 Mal für mindestens 10 min bei RT mit 100 μl Waschlösung.
- Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (Konjugat mit verschiedenen Fluorophoren), Ziege Anti-Kaninchen zum Nachweis von PGP9,5 (1:700) und eine Ziege Anti-Maus zum Nachweis von 5G4 (1:700) in der Arbeitslösung.
- Die Schnitte werden für 90 min bei RT in neue Vertiefungen mit 100 μl der Arbeitslösung der Sekundärantikörper überführt. Decken Sie ab diesem Zeitpunkt die 96-Well-Platte mit Aluminiumfolie ab, um das Ausbleichen von Fluorophoren zu vermeiden, die mit Sekundärantikörpern konjugiert sind.
- Waschen Sie die Abschnitte wie in Schritt 4.3 2 Mal für mindestens 10 min mit 100 μL der Waschlösung.
- Die Schnitte werden für 5 min bei RT in neue Vertiefungen mit 100 μl 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, verdünnt 1:5.000 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] 1x) überführt.
- Waschen Sie die Abschnitte wie in Schritt 4.3 2 Mal für mindestens 10 min mit 100 μL der Waschlösung.
- Montieren Sie die Abschnitte in der richtigen Position auf einer Rutsche, um Fehlfalten zu vermeiden.
- Geben Sie ein paar Tropfen des Montagemediums auf die Folie und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
- Lassen Sie die Objektträger O/N trocknen, bevor Sie das Konfokal-/Fluoreszenzmikroskop verwenden.
- Lagern Sie die Objektträger in einer geeigneten Box bei 4 °C und vermeiden Sie die Lichteinwirkung. Bei genauer Speicherung ist das Signal etwa 6 Monate lang sichtbar.
Anmerkung: Die Übertragung eines Abschnitts von der 96-Well-Platte, die die neu geschnittenen Scheiben enthält, auf die 96-Well-Platte mit der Waschlösung (Schritt 4.1) erfolgt mit einer kleinen Bürste, die bei der Aufnahme der Biopsie hilft. Nach dem Transfer des Abschnitts in die erste Vertiefung wird die Scheibe jedes Mal, wenn sie mit einer anderen Lösung inkubiert werden muss, mit Hilfe der Bürste von Vertiefung zu Vertiefung bewegt.
>5. Immunfluoreszenz-Bildgebung
- Betrachten Sie Schnitte unter einem inversen Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop (20-fache, 40-fache oder höhere Vergrößerung, verwenden Sie aufeinanderfolgende Bilder in Schritten von 2 μm auf einem Z-Stapel-Plan, um optimale Ergebnisse zu erzielen).
- Erfassen von Bildern mit einer an das Mikroskop angeschlossenen Kamera
- Verwenden Sie eine geeignete Bildgebungssoftware (z. B. ImageJ), um positive Signale in Bezug auf die räumliche Verteilung und Intensität des Signals in Abschnitten zu analysieren. Führen Sie dazu die unten genannten Schritte aus.
- Öffnen Sie die Datei mit der ImageJ-Software.
- Klicken Sie auf Bild > Farbe > geteilten Kanälen, um jeden Farbkanal zu analysieren.
- Klicken Sie auf Bild > > Z-Projekt stapeln, um eine Zusammenführung mehrerer Schnitterfassungen zu erhalten.
- Klicken Sie auf Bild > Farbe > Kanäle zusammenführen, um eine Zusammenführung verschiedener Farbkanäle derselben Aufnahme zu erhalten.
Tabelle 1: Erforderliche Lösungen. Liste der erforderlichen Lösungen für das Protokoll und kurze Beschreibung, wie es vorbereitet wird.
Frostschutzlösung
(bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern) | 30% Glycerin
30% Ethylenglykol
30% dH2O
10% 2x Phosphatpuffer |
Lösung blockieren
(Vorbereitung im Moment) | 4% Normales Ziegenserum
1% Triton X-100
in Waschlösung |
Kryo-Schutzmittel
(bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern) | 20% Glycerin
80% Sørensens Lösung |
Dinatriumhydrogenphosphatlösung
(bei RT bis zu 6 Monate lagern) | 0,45M Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) in dH2O
Filter in einer sterilen Flasche |
Lysin-Lösung
(bis zu 3 Wochen bei 4 °C lagern) | 50% 0,3 M L-Lysin-Monohydrochlorid-Lösung
50% der 0,1M Sorensen-Lösung pH 7,6
pH 7,4, Filter in steriler Flasche |
Paraformaldehyd (PFA) 8%
(unter Abzug zubereiten und bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern) | 2,6 M PFA in dH2O (bis 55°C_do 60 °C nicht überschreiten, um Ameisensäurebildung zu vermeiden)
Filter in einer sterilen Flasche |
Phosphatpuffer 2x
(bis zu 6 Monate bei 4 °C lagern) | 6%ige Mononatriumphosphat (NaH2PO4) Lösung
45%ige Dinatriumphosphat (Na2HPO4) Lösung in dH2O |
PLP-Fixierlösung
(Bereiten Sie sich im Moment vor, unter Abzug) | 25% Paraformaldehyd 8%
0.01M Natrium (Meta)periodat
75% ige Lysin-Lösung |
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat
(bei RT bis zu 6 Monate lagern) | 0,52 M Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4*H2O) in dH2O
In einer sterilen Flasche filtrieren. |
Die Lösung von Sørensen
(bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern) | 2,5%ige Mononatriumphosphatlösung
18,7%ige Dinatriumphosphatlösung
pH 7,6, in dH2O |
Waschlösung
(Vorbereitung im Moment) | 0.25M Trizma base
0,26 M NaCl
pH 7,6, in dH2O |
Funktionierende Lösung
(Vorbereitung im Moment) | 50% Blocklösung
50% Waschlösung |
