Verwendung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie zur Beurteilung von Darmentzündungen bei Mäusen

Zusammenfassung

Quelle: Nowacki, T. M., et al. Fluoreszenz-vermittelte Tomographie zum Nachweis und zur Quantifizierung von Makrophagen-bedingten murinen Darmentzündungen. J. Vis. (2017)

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Beurteilung der intestinalen Makrophageninfiltration in einem Mausmodell der Kolitis mittels Fluoreszenz-vermittelter Tomographie (FMT). Bei der Induktion einer Kolitis bei einer Maus über Dextran-Natriumsulfat (DSS) werden dem Tier Antikörper injiziert, die den F4/80-Glykoproteinmarker auf infiltrierten Makrophagen im Dickdarm erkennen. Die Maus wird dann in einem FMT-Gerät abgebildet, wo die Fluoreszenz- und Reflexionssignale in ein dreidimensionales Bild rekonstruiert werden, um die räumliche Verteilung und Intensität der Fluoreszenz zu bestimmen.

Protokoll

Alle Verfahren, an denen Tiermodelle beteiligt sind, wurden vom lokalen institutionellen Tierpflegeausschuss und dem Tierprüfungsausschuss von JoVE überprüft.

>1. Materialien und Versuchsaufbau

1. Tierpflege.
   1. Verwenden Sie Mäuse mit einem Körpergewicht von 20-25 g, die dem Geschlecht und dem Alter entsprechen, z. B. eines DSS-anfälligen Stammes (z. B. C57BL/6).
   2. Planen Sie mindestens fünf oder mehr Mäuse pro Versuchsgruppe und halten Sie die Mäuse gemäß den örtlichen Tierhaltungsrichtlinien.
   3. Stellen Sie eine Standard-Nagetiernahrung und autoklaviertes Trinkwasser ad libitum bereit.
   4. Entfernen Sie das Standardfutter und ersetzen Sie es mindestens drei Tage vor dem Scannen durch ein luzernefreies Chow, um die endoluminale Autofluoreszenz zu reduzieren.
2. Induktion einer akuten DSS-induzierten Kolitis.
   1. Löse 2 g DSS (Molekulargewicht ~40.000 Da) in 100 ml autoklaviertem Trinkwasser auf, um eine 2%ige Lösung (w/v) zu erhalten.
   2. Füllen Sie den Trinkvorrat der Mäuse ausschließlich mit der DSS-Lösung und schätzen Sie 5 mL Flüssigkeit pro Maus und Tag. Geben Sie den Kontrollmäusen das gleiche Trinkwasser ohne DSS.
      Anmerkung: Überwachen Sie die Mäuse täglich bis zum Ende des Experiments. Euthanasieren Sie die Mäuse, die mehr als 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren oder sterben (d. h. anhaltend gebeugte Haltung, verminderte Bewegung, erschwertes Atmen, deutlich aufrechtes Fell) gemäß den lokal geltenden Richtlinien zum Tierschutz.
3. Erstellung einer Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
   1. Markieren Sie den gewünschten Antikörper (z. B. Ratten-Anti-Maus F4/80) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Cyanin7,_λ-Anregung: 750 nm,_λ-Emission: 776 nm), wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Dialysieren Sie den gereinigten Antikörper in einer geeigneten Dialysemembran (Porengröße < 50-100 kDa) gegen 1 l 0,15 M Natriumchlorid für mindestens 2 h oder über Nacht.
      1. Den Antikörper auf 1 l 0,1 M NaHCO₃ übertragen und mindestens 2 h dialysieren.
      2. Löse die erforderliche Menge Fluoreszenzfarbstoff in Dimethylsulfoxid (DMSO) (10,8 μl/mg Antikörper) auf und füge ihn der Antikörperlösung hinzu. Verwenden Sie den Fluoreszenzfarbstoff im 20-fachen molaren Überschuss, um ein Farbstoff-Protein-Verhältnis von 1:3 zu erreichen.
      3. Im Dunkeln bei 4 °C für 1 h inkubieren. Unmarkierte Antikörper durch Dialyse gegen 1 l 0,15 M Natrium oder mit einer PD-10-Entsalzungssäule entfernen und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für die In-vivo-Anwendung auflösen.
      4. Bestimmen Sie die endgültige Antikörperkonzentration und das Markierungsverhältnis durch Spektrophotometrie.
      5. Messen Sie die Proteinkonzentration bei einer Absorption von 250-330 nm und ziehen Sie eine zusätzliche Absorption durch den Farbstoff in Betracht. Korrigieren Sie die maximale Absorption bei 280 nm (Protein) um 11 % der maximalen Absorption bei 750 nm (nächster Schritt) für die Cyaninmarkierung.
      6. Messen Sie eine Verdünnung der Verbindung (typischerweise 1:10) bei 250-800 nm und extrahieren Sie die Konzentration von Cyanin7 bei 750 nm.
      7. Bestimmen Sie das Farbstoff-Protein-Verhältnis wie folgt: Farbstoff/Antikörper = maximale Absorption bei 750 nm / 200.000 / (maximale Absorption bei 280 nm - 0,11 x maximale Absorption bei 750 nm) / 170.000.
      8. Halten Sie die Antikörperlösung bei 4 °C und schützen Sie sie vor Licht, um ein Ausbleichen vor der Injektion zu vermeiden.
   2. Laden Sie das erforderliche Volumen der Antikörperlösung unmittelbar vor der Injektion in eine sterile Spritze und schützen Sie sie vor Licht, bis sie verwendet wird.
   3. Bestimmen Sie den optimalen Zeitpunkt der Sondeninjektion und des Scanvorgangs, abhängig von der Pharmakokinetik des Tracers.
   4. Betäuben Sie die Mäuse mit 1,5 - 2,5 % inhaliertem Isofluran in Sauerstoff oder legen Sie sie sicher in einen speziellen Fixierapparat für die Schwanzveneninjektion der markierten Antikörper.
   5. Bei Antikörpern in voller Länge ist der markierte Antikörper mindestens 24 Stunden vor dem Scannen zu injizieren, z. B. für die Visualisierung von F4/80-Makrophagen gegen Maus bei muriner Kolitis. Injizieren Sie Mäusen intravenös (i.v.) über die Schwanzvene markierte Antikörper in einer Menge, die 2,0 nmol Farbstoff entspricht.
   6. Verwenden Sie gleich markierte unspezifische Antikörper (z. B. Ratten-IgG oder einen anderen Isotyp, der dem primären Antikörpererbe entspricht) als Isotypkontrolle in Dosen, die denen der spezifischen Sonde entsprechen.
      Anmerkung: Die Ergebnisse von in vivo Scans nach Injektion der Kontrollmasse können als Referenz für die Interpretation der spezifischen Sondenbildgebungsdaten dienen.
   7. Rasieren Sie das Tierfell im Bauchbereich mit einem Elektrorasierer, um die Lichtreflexion und -absorption zu minimieren.

>2. Technische Ausrüstung

1. Verwenden Sie ein veterinärmedizinisches Fluoreszenztomographiegerät (FMT) für die Fluoreszenz von Kleintieren (Abbildung 1).
2. Erstellen Sie für jedes Projekt eine neue Studie, indem Sie auf die Schaltfläche "Neue Studie" klicken, und fügen Sie in die Studienbeschreibung die relevanten Tracer ein, einschließlich der bildgebenden Parameter und Dosen für zukünftige Referenzen.
3. Innerhalb dieser Studie erstellen Sie Studiengruppen entsprechend dem jeweiligen Studiendesign (z.B. für den spezifischen Tracer und die unspezifische Isotypkontrolle), indem Sie auf die Schaltfläche "Neue Studiengruppe" klicken. Rüsten Sie jede Studiengruppe mit der jeweiligen Anzahl an Tieren aus.
4. Kalibrieren Sie das System für die Tracer-Konstrukte.
   1. Führen Sie die Kalibrierung für jede Charge von Tracern durch, um die Variation in der Markierung zu normalisieren und die quantitative Messung aus OI-Daten zu ermöglichen.
   2. Befolgen Sie die Anweisungen des Geräteherstellers für die Kalibrierung jedes einzelnen Systems. Nach Auswahl von "Neuen Tracer hinzufügen" führt das System durch die Schritte. Geben Sie die Verdünnung der aufgetragenen Antikörperlösung und die berechnete absolute Konzentration des Tracers in der Sonde an.
   3. Verwenden Sie für FMT ein gewebeähnliches Phantom mit definierter Dicke und Absorptionseigenschaften (ähnlich dem vitalen Gewebe) und füllen Sie es mit einem bestimmten Volumen der verwendeten Antikörperlösung. Messen Sie dies auf dem FMT-Gerät.
      Anmerkung: Das System verwendet die Referenzmessung der bereitgestellten Sonde zusammen mit der gegebenen Konzentration, um absolute Tracerkonzentrationen aus zukünftigen in vivo-Messungen zu berechnen.
5. Verwenden Sie eine beheizbare Untersuchungskassette mit einer Temperatur von 42 °C.
   Anmerkung: So wird verhindert, dass die Mäuse während der Untersuchung unterkühlen.

>3. Tieranästhesie

1. Verwenden Sie einen kontinuierlichen Fluss von 1,5 - 2 Vol.-% Isofluran ([2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan]) und 1,5 L O₂/min, um die Mäuse zu betäuben. Verwenden Sie speziell entwickelte Inhalationssysteme für die Nagetieranästhesie (Isofluran-Verdampfer), um die Anästhesietiefe einfach zu kontrollieren und die Exposition des Personals zu minimieren.
2. Setzen Sie die Maus in die auslaufsichere Induktionskammer und schalten Sie den Verdampfer für die Isofluranzufuhr ein (100% (v/v), 5 Vol% in Sauerstoff, 3 l/min). Überwachen Sie die Maus, bis sie liegend und bewusstlos ist.
3. Legen Sie es in die Untersuchungskassette für die Tomographie, mit kontinuierlicher Isofluran-Inhalation über den Nasenkonus in einer Dosis von 100 % v/v, 1,5 Vol% in Sauerstoff, 1,5 l/min, um Bewegungsartefakte während der Untersuchung zu minimieren. Bei Eingriffen, die länger als 5 Minuten dauern, tragen Sie Augensalbe auf die Mausaugen auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
4. Beurteilen Sie die Narkosetiefe, indem Sie die Reflexe überprüfen. Lege die Maus auf den Rücken; Wenn eine Narkose ausreicht, sollte sich die Maus nicht umdrehen. Kneifen Sie die Maus sanft zwischen ihre Zehen; Wenn eine Narkose ausreicht, wird das Bein nicht zurückgezogen (Stadium der chirurgischen Verträglichkeit).

>4. Fluoreszenz-vermittelte Tomographie

HINWEIS: Passen Sie die folgenden Details, die spezifisch für das in dieser Studie verwendete FMT-System sind (siehe Materialtabelle), für alternative Fluoreszenz-Reflexions-Bildgebungsgeräte oder FMT-Systeme nach Bedarf an.

1. Legen Sie die anästhesierte Maus auf den Rücken in die Untersuchungskassette.
2. Führen Sie den Scanvorgang durch.
   1. Setzen Sie die Kassette in das Bildgebungssystem ein und schließen Sie sie sofort, um eine kontinuierliche Anästhesie zu gewährleisten. Wählen Sie die entsprechende Stichprobe aus der zuvor erstellten Studiengruppe aus. Wählen Sie den verabreichten Tracer aus dem Dropdown-Menü aus, um sicherzustellen, dass die Werte für die Tracerkonzentration korrekt berechnet werden.
   2. Erfassen Sie ein Fluoreszenzreflexionsbild mit der entsprechenden Wellenlänge (720 nm für Cyanin7) für die Scanplanung und skizzieren Sie das Scanfeld, indem Sie auf die Schaltfläche "Bild aufnehmen" klicken.
   3. Achten Sie darauf, dass das Scanfeld als Überlagerung auf dem Fluoreszenzreflexionsbild angezeigt wird. Passen Sie es an die gewünschte Region (z. B. Dickdarm oder Bauch) an und vermeiden Sie Luft oder Bereiche mit verbleibendem Fell. Je nach Bildziel stellen Sie die Anzahl der Bilddatenpunkte innerhalb des Scanfeldes ein, indem Sie im Menü rechts zwischen der groben, mittleren und feinen Scanfeldauflösung wählen.
      Anmerkung: Denken Sie daran, dass ein feines Scanfeld eine bessere räumliche Auflösung auf Kosten einer deutlich längeren Scanzeit bieten kann.
   4. Starten Sie die Daten-/Bildaufnahme bei der ausgewählten Wellenlänge, indem Sie auf "scannen" klicken
      Anmerkung: Die Scanzeit für einen mittelfeinen Scan des gesamten Bauches beträgt ca. 5 Minuten; In dieser Zeit wird jeder Datenpunkt separat vom Anregungslaser beleuchtet und die resultierende Fluoreszenz aufgezeichnet.
   5. Nehmen Sie das Tier am Ende des Scans aus der Bildgebungskassette und lassen Sie das Tier vollständig genesen, bevor Sie es wieder in den Käfig setzen.
   6. Wiederholen Sie die FMT, wenn dies zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments als notwendig erachtet wird (z. B. an den Tagen 0, 5 und 9 - 10 (Ende des Experiments)), aber berücksichtigen Sie die Akkumulation von Antikörpern im Körper, wodurch das Hintergrundfluoreszenzsignal erhöht wird.

>5. Datenrekonstruktion und -interpretation

1. Verwenden Sie das Rekonstruktionswerkzeug der jeweiligen Bildgebungssoftware, um 3D-Karten der Fluoreszenzverteilung aus den Rohbilddaten zu erstellen; Scans werden automatisch zum Rekonstruktionswerkzeug hinzugefügt, wenn beim Scannen die Funktion "Zur Rekonstruktionswarteschlange hinzufügen" ausgewählt wird.
   1. Andernfalls wählen Sie die Scans aus dem Dropdown-Menü unter der jeweiligen Studie und Studiengruppe aus, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Scan und wählen Sie "Zur Rekonstruktion hinzufügen".
2. Für die weitere Analyse laden Sie einen Datensatz in die Analysesoftware. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü in der oberen Leiste die jeweilige Studie aus und wählen Sie dann die Studiengruppe und das einzelne Tier aus dem Menü auf der rechten Seite aus; Es werden alle Scans angezeigt, die für dieses Tier durchgeführt wurden. Wählen Sie den richtigen Scan aus und klicken Sie auf "Laden"
   Anmerkung: Die 3D-Rekonstruktion der Tracerverteilung erscheint auf der linken Seite als Überlagerung des ursprünglich aufgenommenen Fluoreszenzreflexionsbildes. Das Modell kann gedreht und vergrößert werden, um die Analyse zu erleichtern.
3. Identifizieren Sie Herde mit unspezifischer Markierungsakkumulation (z. B. Leber oder Urinblase) auf rekonstruierten 3D-Karten und differenzieren Sie sie von Zielgeweben (z. B. Darm oder Darm).
4. Wählen Sie in der oberen Leiste die ROI-Form aus, die für das Ziel am besten geeignet ist. Markieren Sie das Zielgewebe als "Regions of Interest" (ROI), indem Sie die entsprechenden Messwerkzeuge in der Analysesoftware platzieren. Die Software liefert eine Fluoreszenzintensität für den ROI sowie (Piko-)molare Mengen des Tracers, für die der Scan kalibriert wurde.
5. Wählen Sie die Gesamtmenge an Tracer in der entsprechenden ROI, normiert für die ROI-Größe, als das am besten geeignete Äquivalent für die Bewertung der Krankheitsaktivität in Korrelation mit dem entzündlichen Infiltrat (Histologie).
   Anmerkung: Andere Merkmale des ROI können gegebenenfalls als repräsentativ für das jeweilige Modell gewählt werden.

Ergebnisse

Abbildung 1. Tomographische Darstellung von Makrophagen-Infiltraten bei muriner Kolitis.

FMT-Scans an kolitischen Mäusen und nicht-kolitischen Kontrollen, denen Cyanin7-konjugierter Antikörper gegen murines F4/80 verabreicht wurde (n = 5 pro Gruppe). (A) Balkendiagramm: Die Gesamtfluoreszenzintensität im PMOL des Farbstoffs wurde in der ROI ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
reagenzien
Alfalfa-freie Ernährung	Harlan Laboritories, Madison, USA	2014
Bepanthen Augensalbe	Bayer, Leverkusen, Deutschland	80469764
Dextransulfat-Natrium (DSS)	TdB Konsulat, Uppsala, Schweden	DB001
Eosin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	E 4382
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	E 9884
Florene 100V/V	Abbott, Wiesbaden, Deutschland	Nr. B506
Hämatoxylin	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Deutschland	HHS32-1L
O.C.T. Tissue Tek Mischung	Sakura, Zoeterwonde, Niederlande	Artikel-Nr.: 4583	Fixiermittel für histologische Analysen
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS	Lonza, Verviers, Belgien	Artikel-Nr.: 4629
Natriumchlorid 0,9%	Braun, Melsungen, Deutschland	12211095.05.0411
Natriumbicarbonat-Pulver	Sigma Aldrich Deisenhofen, Deutschland	Nr. S5761
Standard-Diät	Altromin, Lage, Deutschland	Nr. 1320
Tissue-Tek Kryoform	Sakura, Leiden, Niederlande	Artikel-Nr.: 4566
Hämoccult (Guajakpapiertest)	Beckmann Coulter, Deutschland	3060
Biotin Ratten-Anti-Maus Anti-F4/80 Antikörper	Serotec, Oxford, Vereinigtes Königreich	MCA497B
Biotin Ratte-Anti-Maus Anti-GR-1	BD Pharmingen, Heidelberg Deutschland	553125
Streptavidin-Alexa546	Molecular Probes, Darmstadt, Deutschland	Nr. S-11225	Anregungs-/Emissionsmaximum: 556/573 nm
Anti-CD11b-Ratten-Anti-Maus-Antikörper TC	Calteg, Burlingame, USA	Nr. R2b06
Aufgereinigter Anti-Maus-Antikörper F4/80	BioLegend, London, Großbritannien	123102
DAPI	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Nr. D9542
FITC-konjugierter Anti-Ly6C-Ratten-Anti-Maus-Antikörper	BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland	553104
FACS-Puffer	BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland	342003
Cy7 NHS Ester	GE Healthcare Europe, Freiburg, Deutschland	PA17104
MPO-ELISA	Immundiagnostik AG, Bensheim, Deutschland	K 6631B
Cy5.5-markierter Anti-Maus-Antikörper F4/80	BioLegend, London, Großbritannien	123127	gebrauchsfertige markierte Antikörper (alternativ)
Anti-Maus F4/80 Antigen PerCP-Cyanin5.5	eBioscience, Waltham, USA	Tel.: 45-4801-80	gebrauchsfertige markierte Antikörper (alternativ)
DMSO (Dimethylsulfoxid)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Tel.: 67-68-5
Isofluran	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	792632
Ethanol	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	64-17-5
Rinderserumalbumine (BSA)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Nr. A4612
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	SRE0032
Ausrüstung
FACS Calibur Durchflusszytometrie-System	BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Deutschland
FMT 2000 In-vivo-Bildgebungssystem	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	FMT2000
True Quant 3.1 Software für die bildgebende Analyse	PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA	In FMT2000 inbegriffen
Leica DMLB Fluoreszenzmikroskop	Leica, 35578 Wetzlar, Deutschland	DMLB
Bandelin Sonopuls HD 2070	Bandelin, 12207 Berlin, Deutschland	HD 2070	Ultraschall-Homogenisator
Einweg-Skalpell Nr. 10	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Z692395-10EA
Metzenbaum Schere 14cm	Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Deutschland	22398330
Luer-Lock-Spritze 5ml	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Z248010
Spritzen-Nadeln	Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Deutschland	Z192368
Falcon Tube 50ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgien	Artikel-Nr.: 352070

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