Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.
>1. Design des benutzerdefinierten Array-Layouts und der Produktion
- Generieren Sie eine Tabelle mit Peptidsequenzen mit entsprechenden Allelaufrufen. Das Array besteht aus 20 Reihen und 30 Spalten und kann bis zu 20x30=600 Spots für Peptide aufnehmen. Abhängig von der Gesamtzahl der Peptide, die in Schritt 1.5 von einem bestimmten Spender aufgezeichnet wurden, und basierend auf unseren früheren Erfahrungen mit zwei Beispielen, die wir ausprobiert hatten, kann das 600-Spot-Array alle Sequenzen aufnehmen, die aus ~2 separaten Transplantationsfällen generiert wurden.
- Planen Sie rational den effizientesten Weg, um die Peptidsätze in das 600-Spot-Format des Arrays einzupassen.
- Wenn mehr als ein Subjekt in ein ganzes Array passt, fügen Sie leere Zeilen nach den Sequenzen des ersten Donors ein, um der Gesamtzahl der Zeilen zu entsprechen, die durch 30 geteilt werden können (die Anzahl der Punkte in einer Zeile im Array).
- Fügen Sie unmittelbar nach der letzten leeren Zeile für den ersten Satz von Sequenzen die gesamte Spalte mit dem Sequenzinhalt aus dem zweiten Transplantationsfall ein.
- Wiederholen Sie diese Schritte, bis das Array gefüllt ist und keine weiteren Kisten hinzugefügt werden können, ohne die 600 Spots zu überschreiten. Wenn ganze leere Zeilen unten gefüllt werden müssen, "verschieben" Sie die leere Zeile so, dass sie zwischen den beiden Donor-Sets positioniert wird. Dieser große Abstand zwischen den Gehäusen erleichtert das Schneiden der Membran nach Abschluss der Synthese - nach Schritt 2.2. unter.
- Programmieren Sie die Peptidsequenzen im Kontext des Array-Layouts. Das Programm des SPOT-Synthesizers nimmt ein Textformat der Sequenzen (eine Zeile, eine Peptidsequenz) an, das direkt durch Speichern der resultierenden Tabelle aus Schritt 1.1.4 als einfaches Textdokument (ohne die extra Spalte(n) für Allelnamen, aa-Positionen usw.) erhalten werden kann.
- Führen Sie die automatisierte Peptidarray-Synthese über den SPOT-Synthesizer durch. Der gesamte Ablauf der Synthese wird in Kudithipudi et al. detailliert beschrieben. Beachten Sie, dass die Fmoc-Synthese von zwei Arrays ~4-5 Tage dauert.
>2. Sondierung und erneute Untersuchung von Antiseren aus einer Zeitreihe eines einzelnen Transplantatempfängers.
HINWEIS: Das Membranarray mit 600 Punkten hat die Abmessungen ~7 cm x 13 cm. Nach der Synthese können die Arrays als trockene Membranen mindestens zwei Jahre bei Raumtemperatur gelagert werden, wenn sie vor direktem Licht geschützt sind. Vermeiden Sie eine übermäßige Faltung der Membran, um ihre Langlebigkeit bei wiederholtem Gebrauch zu erhalten.
- Rehydrieren Sie das Membranarray mit Ethanol und visualisieren Sie Peptidflecken, die mit Ponceau S gefärbt wurden.
- Rehydrieren Sie das Membranarray, das die Peptide trägt, nach einem schrittweisen Verfahren, das in Li et al. optimiert wurde.
- Tauchen Sie die Array-Membran in 20 ml 100 % Ethanol.
- Fügen Sie 20 ml destilliertes Wasser hinzu, um die Lösung auf 50 % Ethanol zu verdünnen, und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
- Wechseln Sie die Immersionslösung dreimal auf 40 mL 100% Wasser und inkubieren Sie sie jeweils 15 Minuten.
- Waschen Sie in einem geeigneten Arbeitspuffer, z. B. 20 ml TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,1 %), dreimal für jeweils 5 Minuten.
- Ponceau S Färbung des Arrays zur Visualisierung synthetischer Peptide
- Geben Sie 20 mL vorformulierte Ponceau S-Lösung direkt in das hydratisierte Array und inkubieren Sie ~30 s lang unter Schütteln.
- Lassen Sie destilliertes Wasser kontinuierlich über die Membran laufen, um die Hintergrundfarbe Ponceau S zu entfärben. Während des Prozesses können rote Peptidflecken sichtbar werden.
- Trennen Sie die Teile des Arrays für jeden Spender, indem Sie für einzelne Fälle vorsichtig zwischen den Abschnitten des Arrays schneiden. Markieren Sie die Ausrichtung jedes Arrays.
- Array vor dem Block.
- Blockieren Sie die Membran in 20 ml 5 % fettfreier Milch, die in TBST-Puffer gelöst ist. Diese Lösung auf Milchbasis entfärbt die Farbe von Ponceau S weiter. Tauschen Sie den Milchpuffer mehrmals aus, um die klarsten Peptidbilder zu erhalten.
- Machen Sie zu Aufzeichnungszwecken ein Foto des Ponceau S-Bildes des Arrays mit einer Handkamera (Beispiel in Abbildung 1).
- Die Verstopfung der Membran in 5%iger fettfreier Milch bei 4 °C über Nacht oder bei Raumtemperatur für 2 h unter Schaukeln fortsetzen.
- Array mit Transplantat-Antiserum inkubieren.
Anmerkung: Es sollte beachtet werden, dass ein Phänomen, das als Prozone oder Hook-Effekt bekannt ist, aus einer komplementabhängigen Interferenz bei der Serumantikörperanalyse resultieren kann. Um dieses Problem zu umgehen, kann ein optionaler Serumvorbehandlungsschritt entweder mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder einer Hitzeinaktivierung von Serumproben in Betracht gezogen werden.
- Entfernen Sie den Blockierungspuffer und waschen Sie die Membran am nächsten Tag dreimal für jeweils 5 Minuten mit 20 ml TBST.
- 20 μl des Rohserums des Empfängers zu 20 ml 2,5 % Milch in TBST-Puffer geben und mit der Membran 2-3 h bei Raumtemperatur inkubieren. Beachten Sie, dass in dieser ersten Sondierungsrunde empfohlen wird, zuerst das letzte Serum nach der Transplantation (oder wahrscheinlich das sensibilisierteste Serum) in der Zeitreihe zu verwenden. Dies basiert auf der Annahme, dass frühere Exemplare in der Serie, insbesondere aus der Zeit vor der Transplantation, eine geringere Vielfalt an Alloantikörpern aufweisen, die dazu neigen, sich im Laufe der Zeit zu entwickeln. Auf diese Weise kann jede Möglichkeit einer Signalinterferenz durch "Carry-over" zwischen den Sondierungsrunden eindeutig von einer wirklich entwickelten Alloantikörper-Reaktivität aufgrund von Immunantworten gegen das Transplantat unterschieden werden.
- Waschen Sie das Array mit 20 mL TBST und inkubieren Sie es mit einem sekundären Antikörper.
- Waschen Sie die Membran dreimal für jeweils 10 Minuten.
- Inkubieren Sie mit einem Ziegen-Anti-Human-IgG-HRP (Meerrettichperoxidase)-Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:10.000 in TBST-Puffer, der mit 1 % Milch für weitere 2 h ergänzt wird.
- Waschen und entwickeln Sie den Klecks.
- Waschen Sie die Membran dreimal mit TBST für jeweils 10 Minuten.
- Führen Sie eine erweiterte Chemilumineszenz (ECL) mit 5 mL Luminollösung durch, die frisch mit 5 mL Peroxidlösung gemischt wird, um die Membran zu entwickeln (für 1 Minute).
- Visualisieren Sie ECL-Signale mit einem geeigneten Imager (z. B. ChemiDoc Imaging Systems oder Azure C600).
- Scannen und quantifizieren Sie den Blot.
- Speichern Sie die entwickelten Bilder (Abbildung 2, unteres Bild) und führen Sie eine Quantifizierung der Spotintensität durch.
>3. Vergleichen Sie die Antiserum-Reaktivität über eine klinische Zeitreihe.
- Entfernen Sie das Array.
- Halten Sie die Membran zu diesem Zeitpunkt immer feucht.
- Die Membran wird durch Inkubation mit 20 mL handelsüblichem Stripping-Puffer bei 37 °C für 20 min abgestreift und anschließend dreimal für jeweils 10 min mit TBST gewaschen. Wiederholen Sie dann die Schritte Blockieren (Schritt 3.2) und Sondieren (Schritt 3.3) mit einem anderen Serum des Patienten, das zu einem anderen Zeitpunkt entnommen wurde.
- Blockieren Sie die abisolierte Membran.
Hinweis: Nach dem Stripping kann die Membran für eine weitere Sondierungsrunde eines anderen Serums desselben Patienten in einer Zeitreihe wiederverwendet werden.
- Blockieren Sie die Membran wie zuvor mit 5 % Milchpuffer (siehe Schritt 2.2).
- Wiederholen Sie die Untersuchung eines anderen Antiserums aus derselben Zeitreihe (wiederholen Sie die Schritte von 2.3-2.6; Beispiel in Abbildung 2, oberes Bild).
Anmerkung: Das abgestreifte Array kann dann verwendet werden, um eine andere Serumprobe erneut zu untersuchen. Da die Peptide kovalent an die Stützmatrix der Membran konjugiert sind, konnten wir zeigen, dass das Array für bis zu 20 Runden von Stripping- und Reprobing-Zyklen wiederverwendet werden kann, ohne seine Leistung zu verlieren.
