Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Zusammenfassung

Quelle: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: a sensitive technique for the analysis of the Repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies in small animals.J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video demonstriert die gedruckte Glykan-Array-Technologie zur Analyse von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern in Mausserum. Die Antikörper im Serum interagieren mit spezifischen Glykanen auf dem Chip, was durch Immunfärbung und anschließende Fluoreszenzuntersuchung bestätigt wird.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Herstellung von Glykochips

1. Microarray-Vorbereitung
   1. Drucken Sie die Glykane (50 mM) und Polysaccharide (10 μg/ml) in 300 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 8,5) bei 6 Replikaten mit einem berührungslosen Roboter-Arrayer (Tropfenvolumen ~900 pL) auf N-Hydroxysuccinimid-derivatisierte Glasobjektträger. Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke von Sub-Arrays (Abbildung 1A, in Farben), die 6 Mal wiederholt werden. Jedes einzelne Sub-Array besteht aus 112 verschiedenen Glykan-Spots, einschließlich Kontrollen (8 Reihen × 14 Spalten) (Abbildung 1B).
      Anmerkung: Informationen zu Glykanen sind in Tabelle 1 enthalten. Die Glykanbibliothek, die für den Druck von Mikrochips verwendet wird, ist das Ergebnis einer langfristigen Synthese des IBCh-Teams. Beispiele für Synthesen sind in verwandten Publikationen beschrieben. Die Glykanbibliothek umfasste Blutgruppenantigene und einige der am häufigsten vorkommenden terminalen Oligosaccharide sowie Kernmotive von N- und O-verknüpften Glykoproteinen und Glykolipiden von Säugetieren, tumorassoziierten Kohlenhydratantigenen und Polysacchariden aus pathogenen Bakterien.
   2. Inkubieren Sie die Objektträger in einer Feuchtigkeitsbox (relative Luftfeuchtigkeit ~70%) bei Raumtemperatur (25 °C) für 1 h.
   3. Blockierende Microarrays: Inkubieren Sie die Objektträger 1,5 h lang mit Blockierungspuffer bei Raumtemperatur (100 mM Borsäure, 25 mM Ethanolamin, 0,2 % (v/v) Tween-20 in Reinstwasser).
   4. Waschen Sie den Glykochip mit Reinstwasser und trocknen Sie ihn an der Luft.
2. Qualitätskontrolle von Glykochips
   1. Analysieren Sie zwei Microarrays aus jeder Charge unter Verwendung einer 1 mg/ml-Lösung eines komplexen Immunglobulinpräparats (CIP, das Immunglobulin enthält: IgG, IgM und IgA), einer 10 μg/ml-Lösung biotinylierter Ziegen-Anti-Human-Immunglobuline als Sekundärantikörper (IgM + IgG + IgA), gefolgt von einer 1 μg/ml-Lösung des entsprechenden fluoreszierenden Streptavidin-Konjugats (über das unten beschriebene Protokoll, siehe Schritt 2).
   2. Scannen und analysieren Sie die Glykochips (siehe Schritt 3, Analyse des Glykanarrays).
   3. Verwenden Sie Microarray-Chargen mit einer Intra- und Inter-Chip-Korrelation von mehr als 0,9.

>2. Glykan-Array-Technik

1. Folgende wässrige Lösungen (in Reinstwasser) werden hergestellt und bei Raumtemperatur (25 °C) gelagert:
   1. Puffer-1: 1 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1 % (v/v) Tween-20 und 0,01 % (w/v) Natriumazid (NaN₃).
   2. Puffer-2: 1 % (w/v) BSA in PBS, 0,1 % (v/v) Tween-20 und 0,01 % (w/v) NaN₃.
   3. Puffer-3: 0,1 % (v/v) Tween-20 in PBS.
   4. Puffer-4: 0,001 % (v/v) Tween-20 in PBS.
2. Glykochip und Probenvorbereitung
   1. Stellen Sie die Aufbewahrungsbox mit den Dias auf den Tisch, bis sie Raumtemperatur (25 °C) erreicht haben.
      Anmerkung: Verwenden Sie puderfreie Latexhandschuhe. Der Glykochip muss durch den unteren Teil des Objektträgers manipuliert werden, wo sich der Barcode befindet. Der Barcode hilft Ihnen, die rechte Seite zu identifizieren und den Kontakt mit der Oberfläche, auf der die Glykane gedruckt sind, zu vermeiden.
   2. Öffnen Sie die Box, nehmen Sie den Glykochip und legen Sie ihn in die Inkubationskammer (25 °C), die bereits mit nassem Filterpapier konditioniert ist, um die Luftfeuchtigkeit in der Kammer konstant zu halten.
   3. In der Zwischenzeit verdünnen Sie das Mäuseserum mit Puffer-1 (1:20) in 1,5-ml-Röhrchen. Die Serumlösung (5 s) mit einem Wirbelmischer homogenisieren.
      Anmerkung: Das Volumen, das benötigt wird, um eine einzelne Glykochip-Oberfläche vollständig abzudecken, beträgt etwa 1 ml.
   4. Nach der Homogenisierung wird das verdünnte Serum bei 37 °C 10 Minuten lang in einem Wasserbad inkubiert, um eine Immunglobulinaggregation zu vermeiden. Die Röhrchen werden 3 min lang bei 10.000 x g und 25 °C zentrifugiert, der Überstand aufgefangen und das gefällte Material entsorgt.
   5. Platzieren Sie den Glykochip vorsichtig in der Inkubationskammer. Inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 25 °C mit 1 mL Puffer-3, um jegliches Restmaterial auf der Oberfläche des Glykochips zu entfernen.
   6. Halten Sie den Glykochip in einer vertikalen Position und waschen Sie ihn erneut mit einigen Tropfen Puffer-3 mit einer Pasteur-Plastikpipette. Entfernen Sie den Puffer vorsichtig mit Filterpapier von der Glykochip-Oberfläche.

>3. Reaktion: Antikörperbindung

1. Platzieren Sie den Glykochip in der Inkubationskammer. Verteilen Sie die verdünnte Serumprobe mit einer Mikropipette auf der Glykochip-Oberfläche. Inkubation unter orbitaler Bewegung (30 U/min) bei 37 °C für 1,5 h. Stellen Sie sicher, dass der gesamte trockene Bereich der Glykochip-Oberfläche mit der Spitze der Pipette von der verdünnten Serumprobe bedeckt ist.
2. Entfernen Sie alle überschüssigen Proben und tauchen Sie den Glykochip 5 Minuten lang in Puffer-3 bei 25 °C. Bringen Sie dann den Glykochip in einen Behälter mit Puffer-4 (5 min) und waschen Sie den Glykochip schließlich (5 min) mit Reinstwasser. Zentrifugieren Sie den Glykochip 1 min lang bei 175 x g und 25 °C, um die Flüssigkeit zu entfernen.

>4. Nachweis: Sekundärantikörper

1. Platzieren Sie den Glykochip in der Inkubationskammer. Auf der Glykochipoberfläche wird eine Lösung (5 μg/ml) von Ziegen-Anti-Maus (IgG + IgM) verteilt, die in Puffer-2 an Biotin konjugiert ist. Unter Orbitalbewegung (30 U/min) bei 37 °C für 1 h inkubieren.
2. Entfernen Sie die ungebundene Fraktion und wiederholen Sie die Waschschritte.
3. Nach der Zentrifugation wird der Glykochip 45 min lang (30 U/min) bei 25 °C im Dunkeln mit 2 μg/ml der entsprechenden Fluorochrom-markierten Streptavidin-Lösung (in Puffer-2) inkubiert.
4. Entfernen Sie in der Dunkelheit die ungebundene Fraktion und wiederholen Sie die Waschschritte.
5. Trocknen Sie den Glykochip an der Luft.
   Anmerkung: Der Glykochip sollte so schnell wie möglich gescannt werden. Wenn es jedoch nicht möglich ist, sofort nach der Färbung einen Scan durchzuführen, können Glykochips an einem kühlen und trockenen Ort in der Dunkelheit gelagert werden.

>3. Analyse des Glykan-Arrays

1. Scannen des Arrays
   1. Lassen Sie den Glykochip auf dem Tisch, bis er im Dunkeln Raumtemperatur erreicht. Schalten Sie gleichzeitig den Diascanner und den Laser (Anregungswellenlänge von 633 nm) ein.
   2. Halten Sie den Microarray fest und schieben Sie den Glykochip in den Schlitz, bis er die Rückseite berührt.
   3. Scannen Sie den Glykochip ("easy scan ausführen"), und speichern Sie den Scan als ". TIFF"-Datei.

Tabelle 1: Liste der Glykane, ihre Bindung an natürliche zirkulierende Antikörper (IgM + IgG) von BALB/c-Mäusen (n = 20), ausgedrückt in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) als Median ± MAD, und die Anzahl der Tiere, die den Cut-off-Wert überschreiten (≥4000 RFU). Diese Tabelle wurde von Bello-Gil, D. et al. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung (nicht maßstabsgetreu) der Konfiguration, des Drucks und der Analyse des Glykan-Arrays.(A) Gedruckte Mikrochips werden mit einer Bibliothek von 419 verschiedenen Glykanstrukturen entwickelt, gefolgt von der Detektion mit einem geeigneten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper. Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke von Sub-Arrays (in Farbe...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper
Biotinyliertes Anti-Human-Igs für Ziegen	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Nr. #: 31782
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	Nr. #: 31807
Ausrüstung
Roboter-Arrayer sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlin, Deutschland	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Beizschale (Objektträger-Inkubationskammer)	Simport, Beloeil, QC, Kanada	Nr. #: M920-2
Zentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Deutschland	Nr. #: 5810 R
Pipetten	Gilson, Middleton, WI, Vereinigte Staaten von Amerika	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Dia-Scanner	PerkinElmer, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	ScanArray GX Plus
Inkubator zum Schütteln	Cole-Parmer, Staffordshire, Vereinigtes Königreich	Nr. #: SI50
Biologische Proben
BALB/c Mäuse Seren	Dieses Papier	N/ A
Komplexes Immunglobulin-Präparat (CIP)	Immuno-Gem, Moskau, Russland	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemikalien, Reagenzien und Glykane
Glykan-Bibliothek	Institut für Bioorganische Chemie (IBCh), Moskau, Russland	N/ A
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Nr. #: A9418
Ethanolamin	Sigma-Aldrich	Nr. #: 411000
Tween-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spanien	Nr. #: 655204
Phospahte-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spanien	Nr. #: E404
Natriumazid	Sigma-Aldrich	Nr. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 Konjugat	Thermo Fisher Scientific	Nr. #: S21381
Streptavidin Cy5-Konjugat	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Vereinigtes Königreich	Nr. #: PA45001
Materialien
N-Hydroxysuccinimid-derivatisierte Objektträger H	Schott-Nexterion, Jena, Deutschland	Nr. #: 1070936
Whatman Filterpapier	Sigma-Aldrich	Nr. #: WHA10347509
1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	Nr. #: 0030120086
Software und Algorithmen
ScanArray Express Microarray-Analysesystem	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray