Nachweis von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern mit einem gedruckten Glykan-Array

Zusammenfassung

Quelle: Olivera-Ardid, S. et al., Printed Glycan Array: a sensitive technique for the analysis of the Repertoire of circulating anti-carbohydrate antibodies in small animals.J. Vis. Exp.(2019)

Dieses Video demonstriert die gedruckte Glykan-Array-Technologie zur Analyse von zirkulierenden Anti-Glykan-Antikörpern in Mausserum. Die Antikörper im Serum interagieren mit spezifischen Glykanen auf dem Chip, was durch Immunfärbung und anschließende Fluoreszenzuntersuchung bestätigt wird.

Protokoll

Alle Verfahren, die die Probenentnahme beinhalten, wurden in Übereinstimmung mit den IRB-Richtlinien des Instituts durchgeführt.

>1. Herstellung von Glykochips

1. Microarray-Vorbereitung
   1. Drucken Sie die Glykane (50 mM) und Polysaccharide (10 μg/ml) in 300 mM phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 8,5) bei 6 Replikaten mit einem berührungslosen Roboter-Arrayer (Tropfenvolumen ~900 pL) auf N-Hydroxysuccinimid-derivatisierte Glasobjektträger. Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke von Sub-Arrays (Abbildung 1A, in Farben), die 6 Mal wiederholt werden. Jedes einzelne S....

Ergebnisse

Abbildung 1: Schematische Darstellung (nicht maßstabsgetreu) der Konfiguration, des Drucks und der Analyse des Glykan-Arrays.(A) Gedruckte Mikrochips werden mit einer Bibliothek von 419 verschiedenen Glykanstrukturen entwickelt, gefolgt von der Detektion mit einem geeigneten fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper. Jede Folie enthält 4 verschiedene Blöcke von Sub-Arrays (in Farbe.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Antikörper
Biotinyliertes Anti-Human-Igs für Ziegen	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Nr. #: 31782
Biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgM + IgG	Thermo Fisher Scientific	Nr. #: 31807
Ausrüstung
Roboter-Arrayer sciFLEXARRAYER S5	Scienion AG, Berlin, Deutschland	http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Beizschale (Objektträger-Inkubationskammer)	Simport, Beloeil, QC, Kanada	Nr. #: M920-2
Zentrifuge	Eppendorf, Hamburg, Deutschland	Nr. #: 5810 R
Pipetten	Gilson, Middleton, WI, Vereinigte Staaten von Amerika	http://www.gilson.com/en/Pipette/
Dia-Scanner	PerkinElmer, Waltham, MA, Vereinigte Staaten von Amerika	ScanArray GX Plus
Inkubator zum Schütteln	Cole-Parmer, Staffordshire, Vereinigtes Königreich	Nr. #: SI50
Biologische Proben
BALB/c Mäuse Seren	Dieses Papier	N/ A
Komplexes Immunglobulin-Präparat (CIP)	Immuno-Gem, Moskau, Russland	http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemikalien, Reagenzien und Glykane
Glykan-Bibliothek	Institut für Bioorganische Chemie (IBCh), Moskau, Russland	N/ A
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,	Nr. #: A9418
Ethanolamin	Sigma-Aldrich	Nr. #: 411000
Tween-20	Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spanien	Nr. #: 655204
Phospahte-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spanien	Nr. #: E404
Natriumazid	Sigma-Aldrich	Nr. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 Konjugat	Thermo Fisher Scientific	Nr. #: S21381
Streptavidin Cy5-Konjugat	GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Vereinigtes Königreich	Nr. #: PA45001
Materialien
N-Hydroxysuccinimid-derivatisierte Objektträger H	Schott-Nexterion, Jena, Deutschland	Nr. #: 1070936
Whatman Filterpapier	Sigma-Aldrich	Nr. #: WHA10347509
1,5 mL Röhrchen	Eppendorf	Nr. #: 0030120086
Software und Algorithmen
ScanArray Express Microarray-Analysesystem	PerkinElmer	http://www.per kinelmer.com/microarray