Eine Peptid-Microarray-Technologie zur Erstellung von Spezifitätsprofilen von Antikörpern

>1. Entwerfen der Array-Folie und des Layouts der Quellplatte

1. Klicken Sie unter der Überschrift "Planen eines Folienlayouts" auf der ArrayNinja-Benutzeroberfläche auf den Link, der dem verwendeten Microarray-Drucker entspricht.
   Anmerkung: ArrayNinja wurde so programmiert, dass es die Roboterbewegung von zwei häufig verwendeten Microarray-Druckern nachahmt (siehe Tabelle 1). Die Kompatibilität mit den anderen Arrayern kann auf Anfrage konfiguriert werden.
2. Klicken Sie in das Dialogfeld "Lastplatte", geben Sie "empty" ein und klicken Sie auf "Enter". In Abbildung 1 sehen Sie einen Screenshot des ArrayNinja-Designmoduls.
3. Passen Sie den Spotdurchmesser auf 275 μm und den Spotabstand auf 375 μm an. Passen Sie die restlichen Einstellungen an (Plattenblöcke/Plattenreihe, Plattenreihen insgesamt, Replikate, Merkmale in y, Super-Arrays, SuperA-Fudge; siehe Abbildung 1), um anzupassen, wie die Merkmale auf dem Microarray-Objektträger angezeigt werden.
   Anmerkung: Der Spotdurchmesser wird durch die Größe des Microarray-Pins bestimmt. Wenn diese Einstellungen angepasst werden, wird die Cartoon-Folie in Echtzeit aktualisiert. Verwenden Sie diesen Cartoon, um eine Vorschau zu erhalten, wie sich die einzelnen Einstellungen am endgültigen Folienlayout ändern.
4. Nachdem das Layout der Features auf der Folie festgelegt wurde, zeigen Sie mit der Maus auf die einzelnen Features, und geben Sie die Feature-ID in das Popup-Dialogfeld ein.
   Anmerkung: Feature-IDs können aus Zahlen, Buchstaben oder Kombinationen bestehen. Dies ist nur für eindeutige Funktionen erforderlich, und ein Dialogfeld wird nicht angezeigt, wenn Replikate ausgewählt sind.
5. Nachdem allen einzigartigen Merkmalen eine Kennung zugewiesen wurde, klicken Sie auf "Ausfüllen". Geben Sie einen Namen für das Folienlayout ein und klicken Sie zum Speichern auf "Platte drucken". Es öffnet sich eine neue Seite, auf der die Anzahl der 384-Well-Quellplatten angezeigt wird, die zur Herstellung des ausgewählten Objektträgerdesigns erforderlich sind, sowie eine Tabelle, die die physische Position jedes Features abbildet, das in die Quellplatte(n) geladen werden soll.
   Anmerkung: Merken Sie sich diesen Namen, da er verwendet wird, um dieses Design bei der Analyse von Microarray-Daten abzurufen. Wenn Sie auf "Drucken Sie Ihre Platte" klicken, wird das Layout in ArrayNinja gespeichert.

>2. Herstellung von Microarrays

1. Vorbereiten der Quellplatte
   1. Verwenden Sie die mit ArrayNinja generierte Map, um die 384-Well-Quellplatte(n) zu erstellen.
      HINWEIS: Detaillierte Beschreibungen der auf dieser Plattform abgefragten Peptide finden Sie an anderer Stelle.
   2. Deponieren Sie 1 - 2 μl jedes Merkmals (z. B. biotinyliertes Histonpeptid) in die richtige Vertiefung der 384-Well-Quellplatte(n).
      Anmerkung: Biotinylierte Histonpeptide werden typischerweise aus 200 - 400 μM Stammlösungen abgeschieden, was einem 10- bis 25-fachen molaren Überschuss des Peptids an Streptavidin-Bindungsstellen in einem einzigen Array-Spot entspricht. Dies wird mit der Gleichung berechnet:
      
      Dabei ist V das Volumen, das von einer Stecknadel abgegeben wird, [P] die Konzentration des zu druckenden Merkmals, NA die Avogadro-Zahl und S die Oberfläche eines Punkts. C ist die Abdeckung des Objektträgers, ausgedrückt als Anzahl der Streptavidin-Moleküle pro Flächeneinheit multipliziert mit drei (die durchschnittliche Anzahl der verfügbaren Streptavidin-Bindungsstellen). V und C beziehen die jeweiligen Hersteller. Andere Merkmale können je nach Größe des Biomoleküls unterschiedliche Konzentrationen erfordern, wobei Engstände ein Problem darstellen können. Eine Reihe von Druckkonzentrationen für jeden neuen Merkmalstyp sollte empirisch getestet werden, um die optimale Druckkonzentration zu bestimmen.
   3. Verdünnen Sie jedes Merkmal 10-fach mit 1x Druckpuffer, ergänzt mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA). Die Quellplatte(n) bei 500 x g 2 min bei Raumtemperatur drehen.
      Anmerkung: Die Aufnahme von Fluorescein-markiertem Biotin (5 μg/μL) in den Druckpuffer wird als Schmierblutungskontrolle und als visuelle Hilfe empfohlen, um die korrekte Ausrichtung des Arrays während der Analyse zu erleichtern (siehe Abbildung 3).
2. Druckprotokoll (Abbildung 2A – B).
   1. Bereiten Sie den Arrayer vor, indem Sie den Abfallsammelbehälter leeren und den Waschlösungsbehälter und den Befeuchterbehälter mit sterilem destilliertem Wasser füllen.
   2. Geben Sie die Parameter, die zum Entwerfen der Folie in ArrayNinja (Abbildung 1) verwendet werden, in das Steuerungsprogramm des Microarray-Druckers ein.
   3. Stellen Sie mit dem Microarray-Druckersteuerungsprogramm den Waschvorgang auf 1 s Waschgang mit einem Eintauchen ein. Stellen Sie die Einstellungen nach dem Waschen so ein, dass die Stifte nach jedem Waschen 5 Mal erneut eingetaucht werden. Stellen Sie die Luftfeuchtigkeit auf 60% ein.
      Anmerkung: Die optimale Waschkonfiguration kann je nach verwendetem Microarray-Drucker variieren. Die optimale Konfiguration des Pin-Dips nach dem Waschen kann je nach verwendetem Microarray-Drucker variieren.
   4. Setzen Sie funktionalisierte Objektträger (z. B. Streptavidin-beschichtetes Glas) in die Substratplatten ein und setzen Sie alle Platten in den Plattenlift ein. Setzen Sie die Quellplatte(n) in die Plattenhalter ein und setzen Sie sie in den Quellenplattenaufzug ein.
   5. Klicken Sie auf "Drucken". Überwachen Sie den Druckprozess für einige Runden der Merkmalsabscheidung, um sicherzustellen, dass alle Wasch- und Taucheinstellungen korrekt sind. Wenn der Drucklauf abgeschlossen ist, entfernen Sie die Substratplatten aus dem Arrayer.
      Anmerkung: Wenn große Auflagen die Fertigstellung von Blockierungsschritten innerhalb eines Tages verhindern, können gedruckte Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C inkubiert werden. Inkubieren Sie die Objektträger neben einem kleinen Becherglas mit Wasser in einem Karton, der mit Plastikfolie verschlossen ist.
   6. Blockieren Sie die Objektträger mit Blockierungspuffer für 30 min bei Raumtemperatur unter Mischen.
   7. Waschen Sie die Objektträger 2 x 10 min bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,6 unter Mischen. Trocknen Sie die Objektträger, indem Sie sie in einer Microarray-Objektträgerzentrifuge 30 s lang bei Raumtemperatur drehen.
      Anmerkung: Für die Bearbeitung einer großen Anzahl von Objektträgern auf einmal kann eine Hochdurchsatz-Objektträgerwaschkammer verwendet werden, mit der 50 Objektträger parallel gewaschen werden können.
   8. Für Objektträger, die für die Trennwand mit Wachs ausgelegt sind, fahren Sie mit Abschnitt 2.1 fort. Bei allen anderen Designs sollten die Objektträger bei 4 °C vor Licht und Feuchtigkeit geschützt gelagert werden.
      Anmerkung: Gedruckte biotinylierte Histonpeptide sind auf diese Weise mindestens 6 Monate lang stabil.

>2. Partitionieren von Microarray-Folien

1. Hydrophober Wachsstift (Abbildung 2C)
   1. Tragen Sie mit einem Wachsstift Wachs auf die Bereiche auf, die Merkmale enthalten. Lassen Sie das Wachs 5 Minuten an der Luft trocknen, bevor Sie mit Abschnitt 3.
      fortfahren. Anmerkung: Nach dem Blockieren können die Array-Spots mit dem Auge sehr schwer zu erkennen sein. Das Objektträgerdesign von ArrayNinja kann maßstabsgetreu gedruckt und als Leitfaden für das Auftragen von Wachs verwendet werden.
2. Silikondichtung (Abbildung 2D)
   1. Ziehen Sie die durchsichtige Folie von der Rückseite der Array-Dichtung ab und legen Sie die Klebeseite nach unten auf den Microarray-Objektträger.
   2. Halten Sie die Dichtung 5 s lang an Ort und Stelle, bevor Sie mit Abschnitt 3 fortfahren.
3. Wachsabdruck (Abbildung 2E)
   1. Bei Objektträgern, die für die Trennung durch Wachs ausgelegt sind, drucken Sie einen Testobjektträger mit 10 % BSA auf Normalglas. Verwenden Sie diesen Testschlitten, um die Wachsdruckerführungen oder Array-Einstellungen zu optimieren und sicherzustellen, dass sich alle Merkmale in den Wachsformkammern befinden.
   2. Erhitzen Sie den Microarray-Wachsimprinter auf 85 °C, bis das gesamte Wachs vollständig geschmolzen ist, ca. 30 Minuten.
   3. Setzen Sie den Objektträger mit der bedruckten Seite nach unten ein und schieben Sie den Objektträger bis zur rechten Führung auf dem Microarray-Imprinter. Ziehen Sie den Hebel nach oben, um die Form mit der Oberfläche des Objektträgers in Kontakt zu bringen. Für 2 S.
      halten Anmerkung: Die Haltezeit kann verändert werden, um eine optimale Dicke des Wachsrandes zu erreichen.
   4. Entfernen Sie schnell den Objektträger und überprüfen Sie die Wachsränder, um sicherzustellen, dass alle Vertiefungen geschlossen sind und dass die Ränder nicht so dick sind, dass sie an den Stellen übergreifen. Lagern Sie die Objektträger bei 4 °C vor Feuchtigkeit und Licht geschützt.
      Anmerkung: Die Haltezeit kann erhöht oder verringert werden, um dickere oder dünnere Ränder zu erhalten.

>3. Hybridisierung eines Histon-PTM-Antikörpers mit einem Peptid-Microarray

1. Hybridisierungspuffer (PBS, pH 7,6, 5 % BSA, 0,1 % Tween-20) vorbereiten.
2. Äquilibrieren Sie den Objektträger in einem Hybridisierungspuffer mit einem Hybridisierungsgefäß. Der gesamte Objektträger wird vollständig mit Hybridisierungspuffer bedeckt und 30 Minuten lang bei 4 °C auf einem Orbitalschüttler bei niedriger Geschwindigkeit inkubiert.
3. Bereiten Sie eine Lösung vor, die verdünnten Histon-PTM-Antikörper in Hybridisierungspuffer enthält.
   Anmerkung: In den Beispieldaten wurden sowohl der Histon-Antikörper #1 als auch der Antikörper #2 im Verhältnis 1:1.000 in Hybridisierungspuffer verdünnt. Als Ausgangspunkt wird ein Verdünnungsbereich empfohlen, der dem für das Immunblotting verwendeten ähnelt.
4. Inkubieren Sie das Array 1 h lang bei 4 °C mit der Antikörperlösung. Entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie das Array 3 Mal für 5 min bei 4 °C mit kaltem PBS, pH 7,6.
5. Bereiten Sie eine Verdünnung von 1:5.000 - 1:10.000 von Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörpern in Hybridisierungspuffer vor.
6. Inkubieren Sie das Array 30 Minuten lang mit einer Sekundärantikörperlösung bei 4 °C lichtgeschützt. Entfernen Sie die sekundäre Antikörperlösung und waschen Sie den Microarray-Objektträger 3 Mal für 5 min bei 4 °C mit PBS, pH 7,6. Tauchen Sie den Microarray in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 0,1x PBS, pH 7,6, um überschüssiges Salz bei Raumtemperatur zu entfernen. Trocknen Sie den Objektträger in einer Microarray-Objektträgerzentrifuge bei Raumtemperatur.
7. Scannen Sie den Objektträger mit einem Microarray-Scanner mit einer Auflösung von 25 μm oder höher gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Scanprotokoll des Microarray-Scanners.
   Anmerkung: Wenn ein fluoresceinmarkierter Biotin-Tracer vorhanden ist, scannen Sie sowohl den grünen Kanal (z. B. 488 nm, em: 509 nm) als auch den Kanal, der dem Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Sekundärantikörper entspricht, typischerweise rot (z. B. 635 nm, em: 677 nm). Das Ziel des Scannens besteht darin, Single-Channel-.tif Dateien zu erhalten, die in einer einzigen .png Datei zusammengeführt werden können.

Abbildung 1: ArrayNinja Design Modul. Ein Screenshot des ArrayNinja-Designmoduls wird in der gestrichelten Linie angezeigt. Auf dem Bedienfeld (oben) werden alle Parameter angezeigt, die am Microarray-Drucker geändert werden können. Wenn diese Parameter angepasst werden, wird das Cartoon-Bild des Folienlayouts (unten links) in Echtzeit aktualisiert. Nachdem das Layout festgelegt wurde, kann der Benutzer mit der Maus über einzelne Stellen fahren, um eindeutige Merkmalskennungen einzugeben. ArrayNinja erstellt aus dieser Benutzereingabe eine Karte der Position jedes Features in den Quellplatten (unten rechts), die zum Erstellen eines bestimmten Microarray-Folienlayouts erforderlich sind.

Abbildung 2: Microarray-Herstellung. (A) Herstellung von Histonpeptid-Microarrays auf Streptavidin-beschichteten Objektträgern unter Verwendung eines Kontakt-Microarray-Druckers. (B) Microarrays, hergestellt mit 3 Subarrays eines 48 x 48 Rasters von Peptidmerkmalen. Trennung von (C) 3 Subarrays mit einem hydrophoben Wachsstift, (D) 2 Subarrays mit einem Silikonkleber und (E) 48 Subarrays mit einem Wachsabdruck. Alle gezeigten Microarrays werden unter Verwendung von 25 x 75 mm großen Objektträgern hergestellt.

Abbildung 3: ArrayNinja Analysemodul. Es wird ein Screenshot des Analysemoduls ArrayNinja gezeigt. Das Bedienfeld (oben links) zeigt alle Parameter an, die angepasst werden können, um das Array zu visualisieren, Punkte zu finden und ein Raster über dem Array-Bild auszurichten. Wenn Sie mit der Maus auf ein Feature zeigen, wird eine vergrößerte Ansicht (oben rechts) und ein Pop-up mit den Identifikationsinformationen angezeigt, die diesem Feature zugeordnet sind (unten). Referenzpunkte, die für die Hintergrundkorrektur ausgewählt wurden, sind orange. Features, die von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen werden sollen, sind weiß. ArrayNinja enthält eine textbasierte Suchfunktion, die übereinstimmende Merkmale gelb hervorhebt, wie im Beispiel für H4K16 gezeigt.