Immunlokalisation von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in pflanzlichem Gewebe

Zusammenfassung

Quelle: Costa, M., et al. Fluoreszierende Immunlokalisation von Arabinogalactan-Proteinen und Pektinen in der Zellwand von Pflanzengeweben. J. Vis. Exp. (2021).

Dieses Video zeigt eine Immunfärbetechnik zur Lokalisierung von Arabinogalactan-Proteinen (AGPs) und Pektinen in Pflanzengeweben. Fixierte und in Harz eingebettete Pflanzengewebeschnitte werden mit AGP- und Pektin-spezifischen primären und fluoreszierenden Sekundärantikörpern und einem Cellulose-bindenden Fluoreszenzfarbstoff gefärbt, um ihre gewebespezifische Kolokalisation in der Zellwand aufzudecken.

Protokoll

>1. Immunlokalisierung

HINWEIS: Das Verfahren zur fluoreszierenden Immunlokalisierung beruht auf der sequentiellen Verwendung von zwei Antikörpern. Der Primärantikörper wird gegen ein bestimmtes Zielantigen erhöht. Der Sekundärantikörper wird spezifisch gegen den Primärantikörper angehoben und für Fluoreszenztechniken an ein Fluorophor (FITC [Fluoresceinisothiocyanat] in diesem speziellen Protokoll) konjugiert. Der Primärantikörper wird verwendet, um das Zielantigen in der Probe nachzuweisen, und der Sekundärantikörper wird verwendet, um die Stelle zu markieren, an der sich der Primärantikörper mit der Probe verbunden hat, nachdem der Überschuss des Primärantikörpers abgewaschen wurde. Kontrollen sind ein wichtiger Bestandteil dieses Assays und müssen immer durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Beobachtungen zu gewährleisten. Eine Vertiefung auf dem Objektträger sollte für die Verwendung als Negativkontrolle reserviert werden, bei der die primäre Antikörperbehandlung übersprungen wird und daher am Ende des Experiments kein Signal beobachtet werden sollte. Es muss eine Positivkontrolle in den Versuch einbezogen werden, indem man mit einem Antikörper behandelt wird, dessen Markierung bereits bekannt und sicher ist. Die Positivkontrolle wird verwendet, um die Wirksamkeit der Sekundärantikörpermarkierung und die Reaktionsbedingungen zu bestätigen, während die Negativkontrolle die Sekundärantikörperspezifität testet.

1. Bereiten Sie eine Inkubationskammer vor, indem Sie einige angefeuchtete Papiertücher auf den Boden einer Pipettenspitzenschachtel legen und sie mit Alufolie umwickeln (Abbildung 1B-1E). Legen Sie die Objektträger in die Inkubationskammer.
2. Pipettieren Sie einen 50 μl Tropfen pro 8 mm Vertiefung der Blockierlösung (5 % fettfreie Trockenmilch (w/v) in 1 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS]) und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang. Entfernen Sie die Blockierungslösung und waschen Sie alle Vertiefungen zweimal 10 Minuten lang mit PBS.
3. Bereiten Sie die primären Antikörperlösungen vor (siehe Tabelle 1), 1:5 (v/v) Antikörper in Blocklösung; nehmen Sie eine Schätzung von etwa 40 μl pro 8 mm Vertiefung vor.
   Anmerkung: Die Konzentration des Antikörpers muss gemäß dem Protokoll des Herstellers angepasst werden.
4. Führen Sie eine abschließende Wäsche mit doppelt destilliertem Wasser (ddH₂O) für 5 min durch, lassen Sie die Vertiefungen niemals vollständig trocknen.
5. Pipettieren Sie die primäre Antikörperlösung in die Reaktionsvertiefungen. Pipettenblockierlösung in die Kontrollvertiefungen.
6. Die Inkubationskammer verschließen und 2 h bei Raumtemperatur stehen lassen, dann über Nacht bei 4 °C. Die Sekundärantikörperlösung, 1 % in Blockierungslösung (v/v) ca. 40 μl pro Vertiefung, vorbereiten. Halte es mit Alufolie abgedeckt.
7. Waschen Sie alle Vertiefungen zweimal 10 Minuten lang mit PBS, danach weitere 10 Minuten mit ddH₂O. Achten Sie darauf, dass keine Spuren der Verstopfungslösung oder Ablagerungen auf den Vertiefungen sichtbar sind.
8. Pipettieren Sie die sekundäre Antikörperlösung in alle Vertiefungen. Schützen Sie die Dias ab sofort vor Licht.
9. 3–4 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
10. Waschen Sie alle Vertiefungen zweimal für 10 min mit PBS, gefolgt von einer weiteren Wäsche von 10 min mit ddH₂O.
11. Tragen Sie einen Tropfen Calcofluor (1:10.000 (w/v) Fluoreszenz heller 28 in PBS) auf jede Vertiefung auf. Tragen Sie ohne Waschen einen Tropfen Eindeckmedium (siehe Materialtabelle) auf jede Vertiefung auf und legen Sie ein Deckglas auf (Abbildung 2H).
12. Betrachten Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit 10x/0,45, 20x/0,75, 40x/0,95 und 100x/1,40 Objektiven ausgestattet ist, verwenden Sie UV- (für Calcofluor-Färbungen) und FITC-Filter, um die Zellwand- bzw. Immunlokalisation zu erkennen (Abbildung 2I). Verwenden Sie die folgenden Wellenlängen: Anregung/Emission (nm) 358/461 für UV und 485/530 für FITC.
13. Zur besseren Visualisierung der Ergebnisse überlappen Sie beide Bilder mit ImageJ oder ähnlichem.

Tabelle 1: Liste nützlicher monoklonaler Antikörper. Die obige Tabelle ist ein Beispiel für verfügbare Antikörper mit Informationen über ihre Ziele und wo sie gekauft werden können.

Name	Affinität	Erhältlich unter
LM2	Arabinogalactan-Protein	Pflanzensonden (Leeds, Vereinigtes Königreich)
LM5	Pektine
LM6	Arabinan
LM7	Homogalacturonan
LM8	Xylogalacturonan
LM13	(1-5)-a-L-ARABINAN
LM14	Arabinogalactan-Protein
LM16	Verarbeitetes Arabinan - RG-I
LM18	Homogalacturonan
LM19	Homogalacturonan
LM20	Homogalacturonan
LM26	VERZWEIGTES GALACTAN
LM30	Arabinogalactan-Protein
JIM5	Niedrig methylverestertes Homogalacturonan	CCRC (Georgien, USA)
JIM7	Hoch methylverestertes Homogalacturonan
JIM4	Arabinogalactan-Protein
JIM8	Arabinogalactan-Protein
JIM13	Arabinogalactan-Protein
JIM15	Arabinogalactan-Protein
JIM16	Arabinogalactan-Protein
JIM20	Extensin
MAC207	Arabinogalactan-Protein

Ergebnisse

Abbildung 1. (A) Schematische Darstellung der Blocktrimmsequenz zur Vorbereitung der Probe (gelber Block) für die Schnittung mit dem Ultramikrotom. Zunächst wird die Gelatinekapsel entfernt (1). Dann werden sie zunächst in einem Winkel von 40° bis 45° zu den Seiten der Kapsel tangential zur Probe (2) getrimmt, ein zweiter Schnitt wird bei 90° der ersten (3) durchgeführt, gefolgt von einem dritten ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
8 Vertiefungen Reaktionsobjektträger aus Glas	Marinfeld	MARI1216750	Andere Marken können verwendet werden
Anti-Ratten-IgG (Wole-Molekül)-FITC-Antikörper werden in GOAT hergestellt	Sigma-Aldrich	Nr. F6258
Deckgläser, 24 mm x 50 mm	Marinfeld	MARI0100222	Das Deckglas sollte alle Vertiefungen abdecken. Andere Marken können verwendet werden
ddH2Ω	Na	Na
Ethanol absolut	Na	Na
Fluoreszierender Aufheller 28	Sigma-Aldrich	Nr. F-6259
Fettfreie Trockenmilch	Nestlé	Na	Jede fettfreie Trockenmilch ist ausreichend
Ofen	Na	Na	generischer Laborofen
Rattengenerierter monoklonaler Antikörper	Pflanzensonden	Na	Mehrere Antikörper, die Zellwandbestandteile erkennen, sind sowohl im Complex Carbohydrate Research Center (CCRC, Georgia University USA) als auch in Plant Probes (Paul Knox Cell Wall Lab, an der Leeds University UK) erhältlich. Eine kurze Liste einiger häufig verwendeter MABS und wo sie erworben werden können, finden Sie in der ergänzenden Tabelle 1
aufrechtes Epifluoreszenzmikroskop mit UV- und FITC-Fluoreszenzfiltern	Leica Mycrosisteme	DMLb
Vakuum-Kammer	Na	Na
Vakuumpumpe	Na	Na
Vectashield	vecta Labs	T-1000	Es können auch andere Anti-Fade-Mittel verwendet werden. Bitte überprüfen Sie die Kompatibilität mit FITC und dem Fluorescente Brightner 28. (Hinweis: Für eine nicht-kommerzielle Alternative (siehe Jonhson et al. 198218) Ein Antifading-Medium kann hergestellt werden, indem 25 mg/ml 1,4-Diazobicyclo-(2,2,2)octan (DABCO) in 9:1 (v/v) Glycerin mit 1xPBS gemischt werden. Stellen Sie den pH-Wert mit verdünntem HCl auf 8,6 ein.)