Verwendung eines Sandwich-ELISA zur Bestimmung des immunogenen Glykoproteingehalts in einem Impfstoff

Zusammenfassung

Quelle: Jallet, C. et al., In-vitro-ELISA-Test zur Bewertung der Wirksamkeit von Tollwutimpfstoffen.J. Vis. Exp. (2020)

Dieses Video zeigt einen indirekten enzymgebundenen Immunsorbent-Assay oder ELISA-Sandwich-Immuncapture-Assay, der zur Bestimmung des immunogenen Glykoproteinspiegels in Impfstoffen entwickelt wurde. Die Assay-Platte, die Glykoprotein-spezifische Antikörper enthält, wird mit seriell verdünnten Impfstoffproben, einschließlich Referenz- und Testimpfstoffen, inkubiert, gefolgt von einem Immunoassay zur Quantifizierung des Glykoproteingehalts im Testimpfstoff.

Protokoll

>1. Sicherheitsvorkehrungen

HINWEIS: Diese Methode ist sowohl auf lebende Tollwutviren (RABV) als auch auf inaktivierte Impfstoffe anwendbar.

1. Verwenden Sie gute Laborpraxis und Sicherheitsverfahren.
2. Tragen Sie angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) wie Einwegkittel, Handschuhe, Masken, Brillen usw.
3. Wenn das lebende Virus titriert ist, verwenden Sie eine biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II.
   1. Betrachten Sie jedes Material, das mit den Proben in Berührung kommt (Reagenzien, Waschlösungen usw.), als infektiöses Material.
   2. Behandeln Sie das kontaminierte Material, indem Sie es 30 Minuten lang in die Bleichlösung (2,5% Natriumhypochlorit) tauchen, um es zu dekontaminieren.
4. Umgang mit Chemikalien in Übereinstimmung mit der guten Laborpraxis.

>2. Vorbereitung

1. Verwenden Sie nach Möglichkeit Reagenzien in analytischer Qualität.
2. Frische Lösungen des Beschichtungspuffers/Karbonatpuffers, des Passivierungspuffers, des Verdünnungsmittels und des Citratpuffers (Tabelle 1) herstellen, durch 0,45- oder 0,22-μm-Filter filtrieren und vor der Verwendung einen Tag lang bei 4 °C lagern, um ihre analytische Reinheit zu erhalten.
3. Lassen Sie die Reagenzien 30 min vor der Verwendung Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) erreichen und homogenisieren Sie sie durch schonendes Mischen vor der Verwendung.

>3. Sensibilisierung von Mikroplatten

HINWEIS: Verwenden Sie 96-Well-Adsorptions-Immunoassay-Platten, die für die Bindung hoher Mengen an Immunglobulinen optimiert sind (siehe z.B. Materialtabelle).

1. In jede Vertiefung werden 200 μl des monoklonalen Antikörpers (mAb-D1) gegeben, der mit dem Karbonatpuffer verdünnt ist.
   Anmerkung: Eine optimale Konzentration von ca. 1 μg/mL wurde experimentell ermittelt und entspricht einer Verdünnung des gereinigten mAb-D1 um ca. 1/2000. Diese empfohlene Konzentration ist für jede mAb-D1-Charge angegeben und muss regelmäßig mit der Positivkontrolle überprüft werden.
2. Decken Sie die Platte mit einer Klebefolie ab und inkubieren Sie die Mikroplatte für 3 h bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre.
3. Den Inhalt der Vertiefung vorsichtig ansaugen und in einen Behälter mit 2,5%iger Natriumhypochloritlösung überführen.
4. Drehen Sie die Mikroplatte um und lassen Sie sie auf einem saugfähigen Papier bei Raumtemperatur 5 Minuten trocknen.

>4. Passivierung von Mikroplatten

1. Geben Sie in jede Vertiefung 300 μl des Passivierungspuffers.
2. Die Platte mit einer Klebefolie abdecken und 30 min bei 37 °C inkubieren.
3. Vorsichtig aspirieren und den Inhalt der Vertiefung in einen Behälter mit 2,5%iger Natriumhypochloritlösung überführen.
4. Drehen Sie die Mikroplatte um und lassen Sie sie auf einem saugfähigen Papier bei Raumtemperatur 1 Min. trocknen
   Anmerkung: Die Mikroplatte kann sofort verwendet oder versiegelt bei -20 °C bis zu 3 Monate bis zur Verwendung gelagert werden.

>5. ELISA-Assay

HINWEIS: Für die Festlegung der Kontrollkurve des Referenzimpfstoffs ist Schritt 5.3 nicht erforderlich; um den getesteten Impfstoff zu titrieren, sind alle Schritte 5.1 bis 5.6 erforderlich.

1. Waschen der sensibilisierten Mikroplatte
   1. Geben Sie in jede Vertiefung 300 μl des Waschpuffers.
   2. Vorsichtig aspirieren und den Inhalt der Vertiefung in einen Behälter mit 2,5%iger Natriumhypochloritlösung überführen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1 und 5.1.2 noch fünfmal, um die sensibilisierte Platte ausgiebig zu waschen.
   4. Drehen Sie die Mikroplatte um und lassen Sie sie auf einem Adsorptionspapier bei Raumtemperatur 1 Minute trocknen.
2. Verdünnungen des Referenzimpfstoffs für die Kontrollkurve
   1. Der Referenzimpfstoff (Validierungsantigen Los 09) wird in 1 ml destilliertem Wasser rekonstituiert, was einer Konzentration von 10 μg/ml Tollwutvirus-Glykoprotein entspricht.
   2. Bereiten Sie eine zehnfache Verdünnung des rekonstituierten Referenzimpfstoffs im Verdünnungsmittel vor, um 1 μg/ml Glykoprotein des Tollwutvirus zu erreichen.
   3. Bereiten Sie 6 serielle zweifache Verdünnungen dieses Referenzimpfstoffs im Verdünnungsmittel vor, wie in Tabelle 1 angegeben.
   4. Verteilen Sie 200 μl des Verdünnungsmittels in doppelter Ausführung (Vertiefungen 1H/2H), um als Blindkontrolle zu dienen.
   5. Verteilen Sie 200 μl pro Vertiefung jeder Referenzimpfstoffverdünnung in doppelter Ausführung (Vertiefungen G1/G2 bis A1/A2).
3. Verdünnungen des getesteten Impfstoffs für seine Titration
   1. Bereiten Sie eine zehnfache Verdünnung des getesteten Impfstoffs im Verdünnungsmittel vor.
   2. Bereiten Sie 7 zweifache Serienverdünnungen des getesteten Impfstoffs in Verdünnungsmittel vor, wie in Tabelle 2 angegeben.
   3. Verteilen Sie 200 μl pro Vertiefung jeder getesteten Impfstoffverdünnung in doppelter Ausführung (Vertiefungen H3/H4 bis A3/A4).
4. Inkubation/Waschen der ELISA-Platte
   1. Decken Sie die Mikroplatte mit einer Klebefolie ab und inkubieren Sie sie 1 h bei 37 °C.
   2. Entfernen Sie die Folie, saugen Sie vorsichtig ab und geben Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter mit 2,5%iger Natriumhypochloritlösung.
   3. Geben Sie in jede Vertiefung 300 μl Waschpuffer.
   4. Aspirieren Sie vorsichtig und überführen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der 2,5%ige Natriumhypochloritlösung enthält.
   5. Die Schritte 5.4.3 und 5.4.4 werden fünfmal wiederholt, um das ungebundene Antigen zu entfernen und die an den beschichteten Antikörper gebundenen G-Protein-Trimere (mAb D1) zu erhalten.
   6. Drehen Sie die Mikroplatte um und lassen Sie sie auf einem saugfähigen Papier bei Raumtemperatur 1 Minute trocknen.
5. Bindung des Peroxidase-konjugierten mAb-D1
   1. Verteilen Sie 200 μl pro Vertiefung der empfohlenen Verdünnung (1/2000) von Peroxidase-markiertem mAb-D1 in Verdünnungsmittel (ungefähre Konzentration von 1 μg/ml). Für jede mAb-D1-Charge ist eine empfohlene Konzentration angegeben, die regelmäßig mit der Positivkontrolle überprüft werden muss.
   2. Decken Sie die Mikroplatte mit einer Klebefolie ab und inkubieren Sie sie 1 h bei 37 °C.
   3. Entfernen Sie die Folie, saugen Sie vorsichtig ab und geben Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter mit 2,5%iger Natriumhypochloritlösung.
   4. Geben Sie in jede Vertiefung 300 μl des Waschpuffers.
   5. Aspirieren Sie vorsichtig und überführen Sie den Inhalt jeder Vertiefung in einen Behälter, der 2,5%ige Natriumhypochloritlösung enthält.
   6. Die Schritte 5.5.4 und 5.5.5 werden fünfmal wiederholt, um den ungebundenen Peroxidase-markierten Antikörper (mAb D1) zu entfernen.
   7. Drehen Sie die Mikroplatte um und lassen Sie sie auf einem saugfähigen Papier bei Raumtemperatur 1 Minute trocknen.
6. Offenbarung mit einem Substrat-Chromogen
   1. Verteilen Sie 200 μl Substrat-Chromogen-Lösung pro Vertiefung.
   2. Verschließen Sie die Mikroplatte mit einer Folie und inkubieren Sie sie im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min. Es entwickelt sich eine gelb-orange Farbe, deren Intensität proportional zur Menge der gebundenen Peroxidase-markierten Antikörper (mAb D1) ist.
   3. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie 50 μl Stopplösung pro Vertiefung hinzufügen.
   4. Wischen Sie die Unterseite der Mikroplatte vorsichtig ab und legen Sie sie in ein Spektralphotometer, um die optische Dichte (OD) bei 492 nm aller verwendeten Vertiefungen zu bestimmen: Negativkontrolle (leer), Referenzimpfstoff und getesteter Impfstoff.
   5. Sammeln Sie Startkapitaldaten in .xls oder .xlsx Dateiformat für die Analyse.

Tabelle 1. Im Assay verwendete Puffer.

geben ein

Puffer und Reagenzien	Präparat
Beschichtungspuffer (Karbonatpuffer 50mM pH=9,6)	Natriumcarbonat 50 mM (Na2CO 3-10H2O) zu Natriumbicarbonat 50 mM (NaHCO3) bis zum gewünschten pH-Wert (ca. 1/10 Vol. Natriumbicarbonat)
Passivierungs-Puffer	0,3 % Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V), 5 % Saccharose in Karbonatpuffer 50 mM pH 9,6
10x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 g, KCl 2 g, Na2PO 4-12H2O 11,33 g, KH2PO4 2g in 1L destilliertem Wasser. Stellen Sie den pH-Wert = 7 mit 4N NaOH
Puffer zum Waschen	0,05% Tween in 1x PBS
Verdünnungsmittel	0,5 % Rinderserumalbumin (Fraktion V), 0,05 % Tween in 1x PBS (pH-Wert auf 7 einstellen wegen Ansäuerung durch BSA)
Citratpuffer pH-5,6 (für Peroxidase-Substrat)	11,67 g Trinatriumcitrat-2H2O (Na3C6H5O7-2H 20), 2,17 g Zitronensäure-1H20 in 1L destilliertem Wasser
Substrat-Chromogen-Lösung	50 mg Ortho-Phenylendiamin-Tablette, 0,1 % Wasserstoffperoxid 30 % (110 vol) in 25 ml Citratpuffer pH 5,6
Lösung wird gestoppt (4N Schwefelsäure)	10 ml H2SO4 36N in 80 ml gekühltem destilliertem Wasser. Die Verdünnung muss im Eisbad erfolgen

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biologische Sicherheitswerkbank der Klasse II	ThermoFisher Scientific	10445753	Bei der Titration von lebenden Viren
Klare, unsterile 96-Well-Immuno-Platten mit flachem Boden, 400 μl, MAXISORP	ThermoFisher Scientific	439454	Gut für die Bindung an den beladenen Antikörper
Equip Labo Laborabzug aus Polypropylen	ThermoFisher Scientific	12576606	Zur Herstellung von Schwefelsäure
Immunologie-Platte Strong Adsorption MAXISORP Flachboden Gut F96	Dutscher	Artikel-Nr.: 55303	Gut für die Bindung an den beladenen Antikörper
Mikrotiterplatten-Dichtband (100 Blatt)	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 15036
Mikroplatten-Singlemode-Lesegerät Sunrise	TECAN
Mikrotiterplatten-Schüttler-Inkubator	Dutscher	441504
Mikrotiterplatten-Waschmaschine Wellwash	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 5165000
Mehrkanalpipette (30-300 μL) 12 Kanäle	ThermoFisher Scientific	Artikel-Nr.: 4661180N
Einkanalpipetten (Kit 2 : Finnpipetten F2 0,2-2 μL Mikro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)	ThermoFisher Scientific	4700880