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>1. Kopplung von magnetischen Nanopartikeln (MNPs)
- Verwenden Sie kommerzielle Kopplungsverfahren und Reagenzien, um MNPs mit Antikörpern (Abs) (typischerweise 1 mg) zu koppeln. Es werden Eisenoxid-Nanopartikel mit Carbonsäure als reaktive Gruppen verwendet.
- Wenn Antikörper ein Volumen von mehr als 0,5 ml haben, konzentrieren Sie sich mit einem 100-K-Konzentrator. Bei 2.000 x g 3-5 min drehen.
- Am Ende des Verfahrens werden nach Zugabe von 10 μl des Abschreckpuffers MNPs in ein 12 mm x 75 mm großes Röhrchen überführt und 3 ml Wasch-/Lagerpuffer hinzugefügt. Legen Sie das Röhrchen in das Mittelloch eines Magnetabscheiders und lassen Sie es über Nacht bei 4 °C.
- Vergewissern Sie sich, dass sich alle MNPs an der Seite des Röhrchens angesammelt haben, und pipettieren Sie dann vorsichtig die gesamte Flüssigkeit heraus. Fügen Sie 3 ml frischen Wasch-/Aufbewahrungspuffer hinzu und setzen Sie ihn wieder in den Magneten.
- Überprüfen Sie nach einigen Stunden, ob sich MNPs an der Seite des Röhrchens angesammelt haben, und pipettieren Sie dann die Flüssigkeit ab. Verwenden Sie 2 ml Wasch-/Lagerpuffer, um die MNPs zu resuspendieren, und lagern Sie sie bei 4 °C.
- Stellen Sie sicher, dass Abs an MNPs gekoppelt sind, indem Sie sie mit einem relevanten fluoreszierenden Fab-Antikörperfragment markieren (z. B. Ziegen-Anti-Maus, wenn ein monoklonales Maus-Ab zur Erfassung verwendet wird, wie in Abschnitt 2 beschrieben) und auf einem Durchflusszytometer laufen lassen.
>2. Markierung von Antikörpern, die an MNPs gekoppelt sind
- Kombinieren Sie 60 μl (3,9 x 1012 Partikel) MNPs (pro Zustand) und 5 μl (einer kommerziellen Lösung mit 200 μg/ml) markierten Fab-Fragmenten, spezifisch für den Isotyp des Einfangs Ab, in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
- 30 min bei Raumtemperatur (RT) unter kontinuierlichem Mischen inkubieren.
- Einen 100K-Konzentrator mit 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vorbefeuchten und in einer Mikrozentrifuge bei 1.500 x g für 5 min schleudern.
- Reinigen Sie markierte Komplexe auf einer 100K-Säule. Die Mischung aus Schritt 2.2 in einer Mikrozentrifuge bei 1.500 x g für 5 min schleudern, mit 200 μl PBS waschen und im Ausgangsvolumen zurückgewinnen.
>3. Verwendung von markierten ab-MNP-Komplexen zum Einfangen von Partikeln von Interesse (extrazelluläre Vesikel, EVs)
- Inkubieren Sie vormarkierte MNPs 60 μl (3,9 x 1012 Partikel) mit EV-Präparation (100 μl).
- Bereiten Sie EV-Vorbereitungen mit verschiedenen Methoden vor. Hier werden EVs auf Saccharosegradienten gereinigt, mit Hilfe von Exosomen-Fällungsreagenzien aus plättchenarmem Plasma gesammelt oder direkt aus dem Plasma isoliert.
Anmerkung: Optimale Verhältnisse müssen für jedes Experiment bestimmt werden und sind abhängig von der Konzentration von EV in der Präparation. Die MNP-Ab-Fraktion sollte ~106 im Vergleich zur Konzentration der EV-Fraktion überschüssig sein.
- 1 Stunde bei 4 °C für Elektrofahrzeuge inkubieren.
- Fügen Sie 2,5% Maus-IgG / humanes IgG hinzu, um die Fc-Bindung zu blockieren, sanft vortexen, 3-5 min bei RT inkubieren.
- Fügen Sie die vom Hersteller empfohlenen oder titerierten Konzentrationen jedes Detektions-Abs hinzu und inkubieren Sie weitere 20 Minuten bei RT.
>4. Trennung der MNP-eingefangenen EVs von ungebundenen Antikörpern mittels magnetischer Säulen
- Bereiten Sie die magnetische Trennsäule für den Gebrauch vor, indem Sie sie in einen Abscheidermagneten einsetzen.
- Befeuchten Sie die Säule mit 500 μl Waschpuffer (2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS). Lassen Sie den Waschpuffer durch die Säule fließen.
- Geben Sie die MNP-EV-Komplexe in die Säule und lassen Sie die gesamte Flüssigkeit durchströmen. Geben Sie 500 μl Waschpuffer in die Säule, so dass das gesamte Volumen passieren kann.
- Wiederholen Sie das Waschen mit dem Waschpuffer noch 2 Mal.
- Nehmen Sie die Säule vom Magneten und setzen Sie sie in ein 12 mm x 75 mm großes Rohr ein, um die zurückgehaltenen MNP-EV-Komplexe zu sammeln. Lassen Sie die Säule 3 min in der Röhre vom Magneten stehen. Fügen Sie 200 μl PBS hinzu und lassen Sie die Kügelchen durch die Schwerkraft nach unten fließen, fügen Sie weitere 200 μl PBS hinzu und fixieren Sie nach der Elution mit 200 μl 4% Paraformaldehyd.
Anmerkung: Paraformaldehyd steht im Verdacht, krebserregend zu sein, und sollte in einer belüfteten Haube gehandhabt werden und Handschuhe tragen.
- Um einzelne EVs zu quantifizieren, verwenden Sie volumetrische Einstellungen am High Throughput Sampler (HTS) oder fügen Sie kurz vor der Erfassung gut gemischte Durchflusszytometrie-Zählbeads hinzu.
>5. Analyse von MNPs-erfassten EVs mit einem Durchflusszytometer
Aufwärmen des - Durchflusszytometers für 30 min.
- Führen Sie Qualitätskontrollperlen durch.
- Legen Sie einen Schwellenwert für die Fluoreszenz von MNPs oder markierten EVs fest. Verwenden Sie 0,22 μm gefiltertes PBS als Schwellenwert, um das Hintergrundrauschen zu verringern. Stellen Sie den Schwellenwert ein, indem Sie die PMT-Spannung auf den Pegel einstellen, bei dem gefiltertes PBS keine oder nur sehr wenige Ereignisse liefert.
- Führen Sie Stichproben auf niedriger Stufe aus. (Verwenden Sie einen zusätzlichen 0,04-μm-Inline-Filter für die Mantelflüssigkeit, der in Reihe hinter dem standardmäßigen 0,2-μm-Mantelfilter angeordnet ist, um Fehlereignisse weiter zu vermeiden).